雙水相萃取尿酸酶和磷酸甘油氧化酶.pdf

1、雙水相萃取技術(shù)是一種利用物質(zhì)在兩相間選擇性分配的分離純化技術(shù)，其原理與水一有機(jī)相萃取原理相似。雙水相體系是指高聚物之間或高聚物與無(wú)機(jī)鹽之間以適當(dāng)?shù)臐舛热芙夂笮纬苫ゲ幌嗳艿膬上嗷蚨嘞囿w系。該體系含水量高，蛋白在其中不易變形；表面張力低，有助于強(qiáng)化相間的質(zhì)量傳遞；分相時(shí)間短，易于放大和連續(xù)操作，萃取環(huán)境溫和，生物相容性好等，考慮到雙水相萃取技術(shù)的以上諸多優(yōu)勢(shì)，因此本文就采用了雙水相萃取技術(shù)分離純化尿酸酶和磷酸甘油氧化酶，建立了適當(dāng)?shù)碾p水相體

2、系，并對(duì)影響萃取效果的各種因素進(jìn)行了研究。同時(shí)對(duì)萃取后，酶的進(jìn)一步分離純化和鑒定作了相關(guān)研究。主要研究結(jié)果如下： 1.選用PEG和硫酸銨作為雙水相體系的組成部分，分別用三種分子量的PEG(即PEG400，PEG600，PEG2Q00)與硫酸銨建立起三種雙水相體系。并確定了組成濃度的范圍。 2.利用三種雙水相體系萃取分離發(fā)酵后的菌體破碎液中的尿酸酶，確定了萃取尿酸酶的最佳PEG分子量為2000。研究了萃取體系中各種因素對(duì)尿

3、酸酶萃取的影響，確立了萃取尿酸的最佳條件。當(dāng)PEG2000為25％，硫酸銨為9％，PH=7.5，NaC12％為，粗酶量為5％時(shí)，萃取后的尿酸酶的純化倍數(shù)達(dá)到了10，回收率約為90％。根據(jù)SDS-PAGE檢測(cè)，得出萃取后的雜蛋白明顯少于萃取前。并采用DEAE陰離子交換層析對(duì)雙水相萃取后的尿酸酶進(jìn)一步純化，通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行鑒定，還原和非還原均得到一條帶。 3.利用雙水相體系萃取發(fā)酵中的磷酸甘油氧化酶，確定萃取GPO的最佳PE