HpSlyD調(diào)控TCTP促進(jìn)CDX2和VIL1表達(dá)誘導(dǎo)胃粘膜腸化生作用的研究.pdf

1、目的:幽門螺桿菌是致胃腸化生(gastric intestinal metaplasia，GIM)最重要的危險因素之一。我們先前的研究表明HpslyD陽性菌株感染與GIM相關(guān)。本研究擬從體、內(nèi)外不同層面探討HpSlyD是否可以促進(jìn)GIM相關(guān)因子CDX2和VIL1表達(dá);探討HpSlyD誘導(dǎo)CDX2和VIL1表達(dá)過程中TCTP的調(diào)控作用，旨在明確HpSlyD誘導(dǎo)GIM發(fā)生可能的信號通路。
　　研究方法:1、利用200ng/ml濃度Hp

2、SlyD作用AGS及N87細(xì)胞系，提取細(xì)胞總RNA和蛋白質(zhì)。采用實時定量熒光-聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)以及蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測CDX2及VIL1在HpSlyD作用前后表達(dá)的變化。2、利用Western blot方法檢測TCTP蛋白在上述HpSlyD作用細(xì)胞系及AGS-HpslyD-GFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的表達(dá)情況;構(gòu)建TCTP-siRNA，建立瞬時低表達(dá)TCTP的AGS、N87細(xì)胞系及AGS-Hps

3、lyD-GFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，Western Blot檢測在TCTP低表達(dá)前后CDX2和VIL1的表達(dá)情況;同時，構(gòu)建TCTP過表達(dá)質(zhì)粒（pCMV6-AC-GFP），建立瞬時高表達(dá)TCTP的AGS和N87細(xì)胞系，Weatern Blot檢測在TCTP高表達(dá)前后CDX2和VIL1的表達(dá)情況。3、利用HpSlyD抑制劑FK506預(yù)處理細(xì)胞系A(chǔ)GS、N87及AGS-HpSlyD-GFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，Real-time PCR及Western blo

4、t比較預(yù)處理前后細(xì)胞CDX2，VIL1及TCTP表達(dá)的變化。4、選取胃鏡活檢淺表性胃炎、腸化型萎縮性胃炎以及胃癌患者胃粘膜石蠟包埋組織標(biāo)本，提取石蠟包埋組織DNA，PCR方法擴增H.pylori保守基因（16s rRNA、glm M等）。在H.pylori陽性人群中，利用PCR方法擴增HpslyD基因保守區(qū)。利用免疫組化方法檢測組織標(biāo)本中CDX2和TCTP的表達(dá)情況。在各種疾病中，比較H.pylori陽性和H.pylori陰性組間及Hp

5、slyD陽性和HpslyD陰性組間上述指標(biāo)蛋白表達(dá)的差異;在HpslyD陽性組中，比較不同疾病組間CDX2和TCTP蛋白表達(dá)的差異;同時探討在不同H.pylori感染狀態(tài)下TCTP和CDX2表達(dá)的相關(guān)性.5、統(tǒng)計分析采用SPSS16.0軟件，體外實驗均重復(fù)三次，結(jié)果用(x)±SD表示，采用兩獨立樣本t檢驗，體內(nèi)實驗采用非參檢驗或者雙側(cè)卡方檢驗。
　　結(jié)果:1、HpSlyD能夠誘導(dǎo)人胃上皮細(xì)胞系中CDX2和VIL1的表達(dá);2、HpS

6、lyD能夠誘導(dǎo)人胃上皮細(xì)胞系TCTP的表達(dá);3、HpSlyD誘導(dǎo)的CDX2和VIL1表達(dá)能夠通過下調(diào)TCTP表達(dá)而被抑制;4、TCTP過表達(dá)能夠上調(diào)CDX2和VIL1表達(dá);5、HpSlyD結(jié)合蛋白FK506能夠阻斷HpSlyD誘導(dǎo)的CDX2、VIL1和TCTP表達(dá);6、在IM-GA和GC中，HpslyD陽性菌株感染與CDX2和TCTP表達(dá)相關(guān);7、隨著胃疾病發(fā)展GS-IM-GA-GC，HpslyD陽性菌株感染促進(jìn)CDX2和TCTP表達(dá);