中國(guó)東北地區(qū)玉米紋枯病菌融合群鑒定及遺傳多樣性研究.pdf

1、隨著緊湊型玉米品種的大面積種植，玉米栽培密度提高，氮肥用量增加，形成有利于玉米紋枯病發(fā)生的小氣候條件。玉米紋枯病已成為我國(guó)玉米主產(chǎn)區(qū)的一種重要病害，其危害日趨嚴(yán)重。東北地區(qū)是我國(guó)春玉米主產(chǎn)區(qū)，玉米紋枯病對(duì)該地區(qū)玉米的危害呈逐年加重的趨勢(shì)，本研究對(duì)該地區(qū)玉米紋枯病菌的融合群類群進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定并對(duì)其優(yōu)勢(shì)致病群AG1-IA進(jìn)行了遺傳多樣性分析，主要研究結(jié)果如下：
　　 1.自中國(guó)東北三省采集玉米紋枯病標(biāo)本300余份，分離獲得286個(gè)絲

2、核菌菌株。融合群測(cè)定結(jié)果表明，這些菌株分別屬于多核絲核菌的AG1-IA、AG1-IB、AG1-IC、AG4-HG-I、AG4-HG-III、AG-5、WAG-Z群及雙核絲核菌的AG-Ba群。其中AG1-IA是優(yōu)勢(shì)致病群，占分離菌株總數(shù)的38.46％，其次是WAG-Z和AG-5群，分別占26.92％及24.83％。AG4-HG-III群菌株是國(guó)內(nèi)首次從罹病玉米植株上分離得到。
　　 2.利用5.8S rDNA-ITS區(qū)序列分析方法

3、，對(duì)該地區(qū)玉米紋枯病菌不同融合群代表菌株的系統(tǒng)演化關(guān)系進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，相同融合群（或亞群）的菌株，序列一致率達(dá)98-100％，而不同融合群（或亞群）菌株之間序列的一致率僅為72％-89％。說(shuō)明此基因序列可以對(duì)絲核菌不同融合群或亞群的菌株進(jìn)行有效區(qū)分和鑒定。依據(jù)本研究測(cè)得的31個(gè)代表菌株及10個(gè)源自GenBank且隸屬不同融合群的菌株所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出,41個(gè)菌株可被劃分為3個(gè)大的分支，其中屬于立枯絲核菌（Rhizocson

4、ia solani）的6個(gè)不同融合亞群（AG4-HG-III、AG4-HG-I、AG-5、AG1-IC、AG1-IB和AG1-IA）的29個(gè)菌株構(gòu)成第一個(gè)分支；第二個(gè)分支由屬于雙核絲核菌AG-Ba群的5個(gè)菌株構(gòu)成；屬于多核絲核菌WAG-Z群的YR-13、YR-18和YR-69等7個(gè)菌株構(gòu)成第三個(gè)分支。進(jìn)一步分析三個(gè)分支間的親緣關(guān)系發(fā)現(xiàn)，屬于雙核絲核菌AG-Ba群的菌株與屬于立枯絲核菌不同融合群菌株間的親緣關(guān)系更近，而屬于WAG-Z群的不

5、同菌株與隸屬立枯絲核菌及雙核絲核菌不同融合群菌株間親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。
　　 3.利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法來(lái)優(yōu)化立枯絲核菌AG1-IA群菌株的ISSR反應(yīng)體系。利用引物UBC809對(duì)體系中Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶和引物的濃度等4個(gè)因素采用L9(34)正交表對(duì)ISSR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化。確定了ISSR擴(kuò)增的優(yōu)化體系為：25μL的PCR體系中含有Mg2+2.2 mmol·L-1、dNTPs 0.15 mmol·L-1、T

6、aq DNA聚合酶0.5 U、引物0.32μmol·L-1、DNA模板0.5μL。
　　 4.利用ISSR-PCR技術(shù)對(duì)采自吉林、遼寧、山東和江蘇等不同地域的中國(guó)玉米主產(chǎn)省份的28個(gè)AG1-IA群菌株的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。從35個(gè)供試引物中篩選出11個(gè)多態(tài)性明顯、條帶清晰、反應(yīng)穩(wěn)定的引物，進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出97條譜帶，其中特征性條帶（多態(tài)性位點(diǎn)）為74條，占總條帶數(shù)的76.3％。依據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，利用UPGMA法，

7、構(gòu)建了其樹狀聚類圖譜。聚類分析結(jié)果表明，供試的28個(gè)菌株的遺傳相似系數(shù)在0.70～0.90，在0.73水平上,28個(gè)菌株可分為4個(gè)ISSR組（IG）。IG1是來(lái)自江蘇的1個(gè)菌株。IG2包括來(lái)自吉林、遼寧的5個(gè)菌株。IG3包括遼寧的1個(gè)菌株和江蘇的1個(gè)菌株。IG4包括剩余的20個(gè)菌株，在0.77水平上，此組又可以進(jìn)一步分為4個(gè)亞組，其中第一個(gè)亞組包括10個(gè)菌株，其中有來(lái)自吉林、遼寧省的7個(gè)和來(lái)自山東的3個(gè)菌株；第二個(gè)亞組包括來(lái)自山東的3個(gè)

8、菌株；第三個(gè)亞組包括遼寧的1個(gè)菌株和山東的1個(gè)菌株；第四個(gè)亞組是來(lái)自江蘇省的5個(gè)菌株。上述結(jié)果表明，來(lái)自不同地域的AG1-IA群菌株既存在一定程度的遺傳分化現(xiàn)象也存在較大程度的相似性，來(lái)自吉林和遼寧的菌株其遺傳相似度更高，來(lái)自東北地區(qū)的菌株與山東的菌株也存在較高的相似度，而與來(lái)自江蘇的菌株間的相似度明顯降低。說(shuō)明AG1-IA融合群菌株的遺傳分化與大范圍的地理位置差異存在較密切的相關(guān)性。
　　 5.利用ISSR-PCR方法對(duì)28個(gè)

9、致病力存在差異的AG1-IA群菌株的遺傳分化現(xiàn)狀進(jìn)行了測(cè)定。從35個(gè)供試引物中篩選出11個(gè)多態(tài)性明顯、條帶清晰、反應(yīng)穩(wěn)定的引物，進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出79條譜帶，其中特征性條帶（多態(tài)性位點(diǎn)）為55條，占總條帶數(shù)的69.62％。依據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，利用UPGMA法，構(gòu)建了其樹狀聚類圖譜。聚類結(jié)果表明，供試的28個(gè)菌株的遺傳相似系數(shù)在0.72～0.95，在0.75水平上,28個(gè)菌株可分為3個(gè)ISSR組：IG1組包括7個(gè)強(qiáng)致病力的菌株；