鱖過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶基因克隆及表達.pdf

1、鱖(Siniperca chuatsi)是我國重要的名貴淡水經(jīng)濟魚類。近年來,鱖常受到細菌、病毒等病害的影響,對鱖的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展產(chǎn)生了極大的影響,造成嚴重的經(jīng)濟損失。本文采用 RACE-PCR的方法克隆了鱖兩個重要的抗氧化酶—CAT和 GPX的 cDNA序列全長,分析了 CAT和 GPX mRNA在鱖組織內(nèi)的表達;另外,對 CAT基因進行了原核表達。
　　1.鱖 CAT cDNA全長為2216bp,包括編碼區(qū)1581bp,3’端非翻

2、譯區(qū)635bp,含有典型的腺苷酸信號序列 AATAAA和 PolyA尾。該基因序列開放閱讀框(ORF)編碼527個氨基酸,預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為59.8 kDa,等電點為7.26。BLAST分析顯示鱖 CAT氨基酸序列和其它物種 CAT基因有很高的同源性。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)鱖 CAT存在高度保守的過氧化氫酶近端血紅素配體簽名序列(354RLFSYPDTH362)和過氧化氫酶近端活性位點(64FDRERIPERVVHAKGAG80)以及3個催

3、化位點殘基“ H”、“ N”和“ Y”。另外,還有三個糖基化位點(148 NNTP151)、(439NFTQ442)和(507 NTTV510),12個NADPH結(jié)合位點和過氧化物酶體靶信號 SKM。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明鱖與條石鯛的親緣關(guān)系最近。實時熒光定量 PCR檢測鱖 CAT的 mRNA在組織中表達情況,結(jié)果顯示鱖 CAT的 mRNA在9種組織中均有表達,其中在肝臟表達量較高。最后,構(gòu)建了 ScCAT+pET-30a重組質(zhì)粒并熱激轉(zhuǎn)入

4、大腸桿菌 BL21(DE3)中,成功地誘導(dǎo)出了 ScCAT的天然可溶性重組蛋白,可用于后續(xù)重組蛋白的純化、分析及抗體生產(chǎn)。
　　2.谷胱甘肽過氧化物酶是生物體機體抗氧化防御系統(tǒng)主要的酶類之一。鱖GPX基因 cDNA序列全長為948 bp,開放閱讀框564 bp,3′非編碼區(qū)384 bp,密碼子 TGA編碼1個硒半胱氨酸( Sec),不是終止密碼子;3′非編碼區(qū)形成1個硒半胱氨酸插入序列(SECIS元件)。鱖 GPX氨基酸序列的硒半

5、胱氨酸插入序列元件屬于 form1,與其它魚類相比具有較高的同源性。氨基酸結(jié)構(gòu)分析顯示,鱖 GPX有 Sec催化位點 Gln71和 Trp148、穩(wěn)定酶三級結(jié)構(gòu)的3個環(huán)、PGGG結(jié)構(gòu)域和由 Sec、Trp、Gln與 Asn構(gòu)成的催化四聯(lián)體。鱖 GPX與脊椎動物 GPX1和 GPX2氨基酸序列同源性為66％-91%。系統(tǒng)進化分析顯示,GPX聚為3大支, GPX1、GPX2和 GPX3聚為一支,GPX4獨為一支。實時熒光定量 PCR檢測鱖G