雞AvBD2成熟肽在畢赤酵母中的表達(dá)及其抗菌活性分析.pdf

1、雞源抗菌肽是生物體受到外界病原微生物入侵時(shí)產(chǎn)牛的一類(lèi)帶正電荷的小分子活性多肽。而雞β-防御素(Avianbeta-defensin)作為抗菌肽中較為重要的一種，因其抗菌譜廣且效率高，作用機(jī)制獨(dú)特，不易使病菌對(duì)其產(chǎn)?？剐缘忍攸c(diǎn)，在抗牛素的抗藥性日趨嚴(yán)重的情況下，極有可能成為新的抗牛藥物的來(lái)源，也因此雞β-防御素成為了人們當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)選雞β-防御素-2(AvBD2)作為研究對(duì)象，運(yùn)用基因工程技術(shù)，將人工合成的AvBD2成熟肽基

2、因成功克隆到pPIC9k載體上，構(gòu)建了pPIC9k-AvBD2重組表達(dá)載體，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后得到含有AvBD2目的蛋白的上清液，對(duì)上清產(chǎn)物的抗菌活性進(jìn)行了研究。具體內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 1AvBD2成熟肽基因的人工合成
　　 根據(jù)NCBI報(bào)道的AvBD2(登錄號(hào)：NM204992)cDNA編碼區(qū)序列，在AvBD2成熟肽基因兩端加上合適的酶切位點(diǎn)EcoRI和NotI后交由TaKaRa公司進(jìn)行AvBD2成熟肽基因的合成。將

3、成熟肽基因克隆到pMD18-T-simple載體上，構(gòu)建成克隆載體pMD18-T-simple-AvBD2。
　　 2AvBD2成熟肽在畢赤酵母中的表達(dá)及體外抑菌試驗(yàn)檢測(cè)
　　 將pMD18-T-simple-AvBD2雙酶切下的AvBD2基因片段克隆到pPIC9k載體，構(gòu)建了pPIC9k-AvBD2表達(dá)載體。PCR鑒定的陽(yáng)性菌株經(jīng)質(zhì)粒提取后做測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)顯示，構(gòu)建的表達(dá)載體中的AvBD2成熟肽基因

4、與GenBank中公布的一致，同源性達(dá)100％。然后將獲得的重組分泌表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-AvBD2用SacI酶線(xiàn)性化，并用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入PichiapastorisGS115，篩選出陽(yáng)性克隆后用甲醇誘導(dǎo)，表達(dá)上清經(jīng)Tricine-SDS-PAGE和抑菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果表明，AvBD2成熟肽基因成功整合到GS115的基因組中，得到了能夠表達(dá)AvBD2成熟肽的穩(wěn)定酵母菌株。誘導(dǎo)表達(dá)的上清液經(jīng)Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)得知AvBD2蛋

5、白分子量在5.8kDa左右，表達(dá)上清能抑制包括大腸桿菌(CMCC44102)、禽致病性大腸桿菌(CVCC1565)、雞白痢沙門(mén)氏菌(S2)、銅綠假單孢桿菌(ATCC27853)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、產(chǎn)氣腸桿菌(CMCC45103)在內(nèi)的多種細(xì)菌的牛長(zhǎng)。
　　 3AvBD2成熟肽表達(dá)上清對(duì)雛雞感染大腸桿菌病的預(yù)防效果研究
　　 以羅曼蛋雞為對(duì)象，初步研究了不同濃度的AvBD2成熟肽表達(dá)上清對(duì)致病菌感染雛雞

6、的預(yù)防效果。本實(shí)驗(yàn)選用了禽致病性大腸桿菌CVCC1565感染雛雞，在確定了細(xì)菌兩次最佳攻毒劑量后，對(duì)11日齡雛雞連續(xù)腹腔注射5天不同濃度的表達(dá)上清液，每天每只0.2mL。于21日齡時(shí)經(jīng)腹腔注射1×109cfu/mL大腸桿菌CVCC1565，0.5mL/只。觀察48h后如果PBS對(duì)照組仍有雛雞存活，則再經(jīng)腹腔注射1×108cfu/mL大腸桿菌CVCC1565，0.5mL/只。之后再觀察48h，確定PBS對(duì)照組雛雞全部死亡后停止感染。結(jié)果發(fā)

7、現(xiàn)，兩次攻毒試驗(yàn)之后，注射不同濃度表達(dá)上清液組雛雞全部存活，而空酵母表達(dá)上清對(duì)照組部分存活，PBS對(duì)照組雛雞全部死亡。由此表明，AvBD2成熟肽表達(dá)上清顯示出了較好的體內(nèi)預(yù)防效果。
　　 綜上所述，本研究成功構(gòu)建了pPIC9k-AvBD2表達(dá)載體，將該表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化到酵母體后經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)到分子量在5.8kDa左右的目的條帶，表達(dá)的AvBD2成熟肽上清對(duì)大腸桿菌(CMCC44102)、禽致病