油茶幾個關(guān)鍵PcG基因的克隆及其表達(dá)分析.pdf

1、油茶是我國南方重要的木本油料樹種。它與油橄欖、油棕和椰子并稱為“世界四大木本食用油料樹種”。種子是油茶油脂來源的主要渠道,但并非唯一的。本研究利用體細(xì)胞胚的發(fā)育能夠誘導(dǎo)油脂生物合成相關(guān)基因的表達(dá)的原理出發(fā),擬通過對胚性基因有抑制作用的PcG基因的RNA沉默來達(dá)到提高油茶愈傷組織含油率的目的。為此,本研究首先對油茶愈傷組織的培養(yǎng)和愈傷組織材料的來源,如芽增殖體系等方面進(jìn)行了優(yōu)化。然后以茶樹的同源基因為模板,克隆出了油茶幾個關(guān)鍵的PcG基因

2、的3`端序列。進(jìn)而以所得序列信息為基礎(chǔ),設(shè)計了雙鏈RNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404,并以油茶PDS發(fā)夾結(jié)構(gòu)的LBA4404轉(zhuǎn)化子的工程菌進(jìn)行了葉片侵染,為進(jìn)行PcG基因的RNA干擾實驗奠定了基礎(chǔ)。共獲得了如下研究成果:
　　1.油茶優(yōu)良無性系葉片的組織培養(yǎng)研究。通過研究得出:1.0mg/LAgNO3、1000mg/L水解絡(luò)蛋白、100mg/L谷氨酸、0.1mM腐胺等能夠快速、高效的誘導(dǎo)出愈傷組織;1/2MS+2％蔗糖+0.7

3、%瓊脂+0.5mg/LTDZ+1.0mg/LIBA+1.0mg/L6-BA+1.0mMGSSG/0.1mM亞精胺的培養(yǎng)基配方可以分化出叢生芽;1/2MS+1.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA為芽增殖的最優(yōu)組合配方。
　　2.克隆油茶PcG基因PRC1與PRC2兩復(fù)合物各組分亞基CLF、PKL、EMF2基因的3`端片段。其中,獲得了油茶EMF2基因的全長cDNA,命名為CoEMF2。該基因閱讀框為1866bp,編碼621個

4、氨基酸。其蛋白分子量為70.54kD,是不穩(wěn)定的疏水性蛋白;卷曲螺旋預(yù)測結(jié)果表明,CoEMF2蛋白中可能存在8個較為明顯的螺旋結(jié)構(gòu);亞細(xì)胞定位表明CoEMF2位于細(xì)胞核中;還發(fā)現(xiàn)CoEMF2中含有兩個保守區(qū):VEFS-Box結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指蛋白。
　　3.油茶PcG基因的RNA干擾研究。利用Gateway技術(shù),以pJawohl8-RNAi載體分別構(gòu)建了油茶CLF、PKL、EMF2以及模式基因PDS的RNA干擾載體;以凍融法導(dǎo)

5、入進(jìn)農(nóng)桿菌LBA4404中,通過測序和特異引物的PCR驗證了這些重組載體和轉(zhuǎn)化子的正確性。
　　4.通過對油茶嫩葉的侵染,初步證明油茶轉(zhuǎn)基因研究是可行的。選擇適當(dāng)?shù)奶鞖?以含有PDS發(fā)夾結(jié)構(gòu)的LBA4404侵染油茶帶有部分傷口的嫩梢/葉,出現(xiàn)了PDS被沉默后特有的漂泊癥狀。
　　5.對幾個關(guān)鍵PcG基因在不同組織中的定量PCR進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)愈傷組織中胚性基因的抑制性染色質(zhì)標(biāo)記H3K27me3的標(biāo)記(CLF)和維持(LHP1)