肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白C和A原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及純化.pdf

1、研究背景
　　 肺表面活性物質(zhì)(pulmonarysurfactant，PS)是由磷脂和蛋白質(zhì)組成的一種具有高度表面活性的復(fù)合物，磷脂含量為85％-90％，蛋白質(zhì)含量為8％-10％。存在于被覆肺泡表面的液體中，其結(jié)合的特異性蛋白為肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白，共有4種，小分子疏水性肺表面活性蛋白B與C，分子量分別為6-8KD和3-5KD，大分子親水性肺表面活性蛋白A與D，分子量分別為28-36KD及43KD。
　　 人類肺表面

2、活性物質(zhì)相關(guān)蛋白C（surfactantassociatedproteinC，SP-C）基因全長2.4kb，定位于第8號染色體短臂，5個內(nèi)含子和6個外顯子，僅表達(dá)于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞。SP-C基因最初可編碼產(chǎn)生含191～197個氨基酸、分子量為21KD的蛋白質(zhì)初級產(chǎn)物SP-C蛋白前體。非成熟的SP-C蛋白前體需經(jīng)過多步復(fù)雜的酶解過程才能分化為成熟并具有生理活性的小分子疏水性蛋白SP-C，具有促進(jìn)磷脂在肺泡表面形成穩(wěn)定的單分子層，從而降低肺

3、泡表面張力、防止呼氣末肺泡塌陷、增加肺順應(yīng)性、促進(jìn)肺間質(zhì)液體回流及參與肺器官局部防御體系等重要的生理功能。
　　 肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A（surfactantassociatedproteinA，SP-A）SP-A基因定位于10號染色體長臂q21～q24，核苷酸長度約為4.5Kb，包含兩個功能基因SP-A1、SP-A2和一個假基因。SP-A由兩種基因編碼:SP-A1和SP-A2，94％的核苷酸序列和96％的氨基酸序列相同.SP

4、-A基因最初可編碼產(chǎn)生含248-263個氨基酸.SP-A單體是一種糖蛋白，相對分子量為26-38KD，由Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和Clara細(xì)胞合成和分泌。天然的SP-A由6個SP-A組成并形成一個“花束狀”結(jié)構(gòu)。其作用包括以下幾個方面①參與肺泡表面活性膜的形成和代謝，與小分子肺表面活性物質(zhì)蛋白B協(xié)同，促進(jìn)表面活性物質(zhì)板層體轉(zhuǎn)化為管髓體結(jié)構(gòu)，繼而參與小分子疏水性肺表面活性物質(zhì)蛋白B與C擴(kuò)展管髓體為磷脂單分子層的作用;②通過受體介導(dǎo)，增加肺泡Ⅱ型

5、上皮細(xì)胞攝取脂質(zhì)，抑制磷脂分泌，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)外肺表面活性物質(zhì)水平，保證肺泡肺表面活性物質(zhì)含量適當(dāng);③肺表面活性蛋白A增加肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞抗氧化能力;④肺表面活性蛋白A與D參與細(xì)胞免疫，對免疫細(xì)胞（尤其是單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞）具有趨化和調(diào)理吞噬作用;⑤肺表面活性蛋白A與D調(diào)節(jié)炎性及過敏反應(yīng)，抑制T細(xì)胞增生，減輕肺過敏性反應(yīng)或其它毒性物質(zhì)在肺部的變態(tài)反應(yīng)。
　　 胎肺從24周開始有肺表面活性物質(zhì)蛋白分泌，32-34周達(dá)到高峰，SP

6、-A是最先被發(fā)現(xiàn)且在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中表達(dá)最強(qiáng)烈、信號最豐富的蛋白，約占SP總量的50％，與肺成熟度密切相關(guān)。SP-A與新生兒呼吸窘迫綜合征(NRDS)、成人呼吸窘迫綜合征、肺炎、哮喘、肺泡蛋白沉積癥(PAP)、特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(IPF)、結(jié)節(jié)病、肺腺癌、系統(tǒng)性硬化等的發(fā)病和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。SFTPC基因表達(dá)異常可致SP-C蛋白含量、結(jié)構(gòu)變化和功能喪失進(jìn)而導(dǎo)致新生兒嚴(yán)重的肺間質(zhì)性疾病、嬰幼兒肺間質(zhì)性疾病如類肉瘤病、彌漫性肺部疾病及部分成

7、人家族性肺纖維化，最后導(dǎo)致呼吸衰竭，這些已經(jīng)被實(shí)驗(yàn)和臨床研究所證實(shí)。因此尋找一種簡便、高效的方法檢測SP的含量對于預(yù)測與之相關(guān)的疾病臨床意義重大。
　　 目前許多評估肺成熟的方法大部分是以PS為分析對象的。大體可分為生物化學(xué)方法和生物物理學(xué)方法兩類。生物化學(xué)方法是定量分析一種或幾種表面活性物質(zhì)成分的絕對量或相對量，包括卵磷脂/鞘磷脂(L/S)測定、磷脂酰甘油(PG)測定、飽和卵磷脂測定等;生物物理學(xué)方法是通過評價羊水或痰液中肺表

8、面活性物質(zhì)成分的肺表面活性或物理效應(yīng)來判斷肺成熟度，包括泡沫振蕩實(shí)驗(yàn)、熒光偏振評價FLM、分光光度計(jì)、LB計(jì)數(shù)等;卵磷脂/鞘磷脂(L/S)測定、磷脂酰甘油(PG)測定生物化學(xué)方法操作復(fù)雜，需時長，容易受羊水血性污染的影響，使用受到一定的限制。生物物理學(xué)方法除泡沫振蕩實(shí)驗(yàn)（主觀性太強(qiáng)）外，其他均需要特定的儀器設(shè)備，且在羊水受到血液或陰道分泌物污染時，準(zhǔn)確率差;由于以上方法的不同缺陷，故目前建立一種非常簡便、準(zhǔn)確，可被大家廣泛接受并應(yīng)用的肺

9、成熟度檢測方法，仍是探索的熱點(diǎn)。
　　 SP-A含量的檢測對于上述多種疾病的診斷和預(yù)后具有很大的價值。杜風(fēng)蘭等研究臍血SP-A水平與羊水SP-A水平的相關(guān)性，證明臍血可以代替羊水SP-A中水平作為胎肺成熟度的標(biāo)志，利用westernblot方法，得到斑點(diǎn)雜交結(jié)果后用凝膠圖象分析系統(tǒng)測定NC膜上各點(diǎn)的相對灰度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白相對灰度值曲線，求得待測標(biāo)本SP-A的實(shí)際含量，尚無法達(dá)到精確測定的標(biāo)準(zhǔn)。YoshioKuroki等利用雙抗

10、體夾心ELISA檢測樣本中SP-A，檢測范圍10～1280ng。此后，以SP-A單克隆抗體為基礎(chǔ)的雙抗體夾心ELISA技術(shù)被廣泛應(yīng)用于SP-A的檢測，在SP-A的研究中發(fā)揮了重要的作用。KojiKaneko等人通過檢測24h內(nèi)新生兒臍帶血及外周血中SP-A含量預(yù)測新生兒呼吸窘迫綜合癥的發(fā)生，確定SP-A是預(yù)測胎兒肺成熟度的重要標(biāo)志。對于肺表面活性物質(zhì)蛋白SP-C來說，目前主要的檢測方法為通過基因檢測的方法了解其基因突變位點(diǎn)，從而確定診斷

11、。多數(shù)SFTPC基因突變患者存在其SP-C蛋白表達(dá)量異常，由于基因診斷價格昂貴，而且耗時較長，可通過檢測SP-C蛋白有無變化進(jìn)行篩查，從而提高預(yù)測肺間質(zhì)性疾病的效率。
　　 目前國內(nèi)市場尚無自研的肺表面活性物質(zhì)蛋白含量檢測試劑盒，而進(jìn)口試劑盒價格昂貴，不宜推廣使用。故研制定量檢測肺表面活性物質(zhì)試劑盒意義重大。而提取SP-A、SP-C蛋白是研制檢測試劑盒的關(guān)鍵一步，本實(shí)驗(yàn)室曾采用maltosyl-agarose柱層析法從人肺支氣管

12、肺泡灌洗液(BALF)中提取出高純度、高活性、結(jié)構(gòu)正常的SP-A，2個成人尸肺中提取的SP-A含量約40mg。但該方法步驟繁瑣，產(chǎn)量少，更重要是尸體肺來源困難，用這種方法提取蛋白作為試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品來源不現(xiàn)實(shí)。SP-C分子量小，體內(nèi)含量比SP-A更低，提取更困難。故利用基因工程方法合成目的蛋白后，將其作為抗原免疫動物，同時作為制備試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品是最佳的選擇。
　　 本實(shí)驗(yàn)室用人尸肺提取的SP-A蛋白作為抗原，免疫BABL/c小鼠，

13、提取脾細(xì)胞后與骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)過篩選抗體后建立了SP-A單克隆細(xì)胞株，并能分泌高效價有活性的SP-A單克隆抗體，為研制SP-A檢測試劑盒做好了準(zhǔn)備（但試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品來源仍有困難）。故本課題擬用原核生物大腸桿菌表達(dá)SPA和SPC目的蛋白，具體研究內(nèi)容包括以下幾個步驟:RT-PCR獲取目的基因、T-A克隆、PET-28a/SP-C及PET-28a/SP-A重組質(zhì)粒的構(gòu)建、SP-C、SP-A重組蛋白的原核表達(dá)及純化、鑒定、目的蛋白的抗原性檢

14、測。
　　 第一步RT-PCR獲取目的基因
　　 目的:通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)獲取目的基因SFTPA，SFTPC。進(jìn)行TA克隆，克隆PCR產(chǎn)物，提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率。
　　 方法:提取肺組織總RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)，2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用PMD-18T載體反應(yīng)試劑盒，連接純化的目的DNA與PMD18T載體，并轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α，在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養(yǎng)

15、基上培養(yǎng)，形成單菌落。計(jì)數(shù)白色、藍(lán)色菌落。
　　 結(jié)果:成功提取到肺組織總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測可見28s和18s兩條條帶亮度清晰，紫外分光光度計(jì)分析A260/A280為1.923，獲得的目的基因2％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與其分子量相符;經(jīng)Amp抗性和藍(lán)白顯色篩選，見培養(yǎng)板上長出藍(lán)白斑比例約為16:1，總菌落數(shù)約32個。挑取白色單菌落接種擴(kuò)增后提取質(zhì)粒。經(jīng)序列測定后，以BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，回收并純化。
　　 結(jié)

16、論:通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)成功獲得SFTPA，SFTPC目的基因。通過TA克隆的方法，可以成功克隆PCR產(chǎn)物。
　　 第二步PET-28a/SP-A，PET-28a/SP-C原核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 目的:構(gòu)建PET-28a/SP-C，PET-28a/SP-A重組質(zhì)粒。
　　 方法:將表達(dá)質(zhì)粒PET-28a及目的基因SP-A、SP-C進(jìn)行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，過夜連接，連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL

17、-21感受態(tài)菌中，加入800μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2h，取50μL涂板(含Kana)后，37℃過夜培養(yǎng)。用無菌牙簽挑取單菌落于5mL含50μg/(1)Amp的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6h，再行質(zhì)粒提取與雙酶切鑒定，鑒定為陽性重組質(zhì)粒送基因公司測序。
　　 結(jié)果:將重組質(zhì)粒送至基因公司測序，與genebank上公布的人肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白基因序列一致，重組質(zhì)粒命名為PET-28a/SP-C、PET-28a/SP-A。結(jié)論

18、:將SP-C及SP-A基因成功克隆到表達(dá)質(zhì)粒PET-28a中。
　　 第三步SP-C、SP-A的原核表達(dá)及純化、鑒定
　　 目的:利用重組質(zhì)粒表達(dá)SP-C及SP-A目的基因，合成目的蛋白SP-C及SP-A
　　 方法:分別將質(zhì)粒PET28a與pET28a-SP-A/C轉(zhuǎn)化至E.coliM15[pREP4]中，37℃培養(yǎng)過夜。次日以5％轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2h后，取3ml菌液，測光吸收值A(chǔ)600;加入IP

19、TG誘導(dǎo)1～5h后，分別收集菌體。表達(dá)產(chǎn)物用12％聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。利用Ni-NTASlurry(agrose)方法進(jìn)行純化，取純化后的蛋白收集物進(jìn)行westernblot鑒定。
　　 結(jié)果:westernblot結(jié)果顯示SP-C、SP-A重組蛋白均為單一印跡，無降解條帶。
　　 結(jié)論:PET-28a/SP-C、PET-28a/SP-A在BL21中得到可溶性表達(dá)，且目的蛋白在表達(dá)過程中無降解。成功構(gòu)建了肺表面活性物

20、質(zhì)相關(guān)蛋白C/A的原核表達(dá)載體，并表達(dá)了目的蛋白SP-C/SP-A。利用Ni-NTASlurry(agrose)方法進(jìn)行純化得到的蛋白純度高。
　　 第四步:目的蛋白的抗原性檢測
　　 方法:將目的蛋白SP-A及SP-C分別與佐劑混合后免疫健康的清潔級BALB/c小鼠各8只。檢測陽性血清不同稀釋倍數(shù)的抗體效價。
　　 結(jié)果:陰性對照組、不同稀釋倍數(shù)組采用單因素方差分析，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(SP-C(∶)F=271.