恥垢分枝桿菌引物合成酶DnaG的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究及c-di-GMP的體外合成.pdf

1、引物合成酶DnaG在原核生物的DNA復(fù)制中有著重要的調(diào)控作用，已有研究表明c-di-GMP和恥垢分枝桿菌的引物合成酶DnaG存在相互作用。但是它們的具體結(jié)合位點(diǎn)、互作機(jī)制及如何共同調(diào)控DNA復(fù)制的機(jī)理都還不清楚。本課題以恥垢分枝桿菌的引物合成酶DnaG為研究材料，從蛋白質(zhì)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)等方面對(duì)DnaG和c-di-GMP的互作機(jī)理進(jìn)行研究。主要研究結(jié)果如下:
　　1.利用DnaG全長和不同結(jié)構(gòu)域構(gòu)建了19個(gè)原核載體并表達(dá)，成功純化了11

2、6-630、121-460、116-440、461-636、477-630、121-630等結(jié)構(gòu)域，用于結(jié)晶。
　　2.通過生物信息學(xué)、不完全酶解及質(zhì)譜的手段，確定了DnaG中460-477這一段為無序結(jié)構(gòu)，連接著TOPRIM結(jié)構(gòu)域和C端的解旋酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
　　3.優(yōu)化121-460的晶體，加入添加劑后，晶體衍射分辨率由7(A)提高到3.8(A)。但是數(shù)據(jù)還不夠好，不能解析結(jié)構(gòu)，還需繼續(xù)優(yōu)化晶體。
　　4.表達(dá)并純化

3、YdeH-pET-28a，利用YdeH體外大量合成c-di-GMP。優(yōu)化合成及純化的工藝，目前可以達(dá)到在反應(yīng)3h后，GTP可以全部被合成為c-di-GMP。12mg YdeH可以合成1mg c-di-GMP。
　　5.利用合成的c-di-GMP與121-460共結(jié)晶，初篩長出晶體，對(duì)晶體進(jìn)行優(yōu)化，但是分辨率不高，晶體優(yōu)化仍需繼續(xù)進(jìn)行。
　　本研究通過大量的蛋白表達(dá)和結(jié)晶嘗試，摸索出了DnaG蛋白純化和結(jié)晶的方法，并確定了Dn