sTNFRⅡ-adiponectin融合蛋白改構體的真核表達、制備及其生物學功能的初步研究.pdf

1、目的：
　　為了增加sTNFRⅡ-adiponectin融合蛋白多聚體的形成和分泌，對sTNFRⅡ-adiponectin基因進行改構。一方面是在sTNFRⅡ基因和adiponectin基因之間加入一段連接肽(linker)，即構成sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白。另一方面是利用44kDa的內質網蛋白(endoplasmic reticulum protein44，ERP44)能滯留新合成的脂聯(lián)素單體，并

2、可以在細胞內形成三聚體、六聚體和高分子量多聚體的特點，合成后的脂聯(lián)素借助ERP44和內質網氧化還原酶1-Lα(endoplasmicoxidoreductin1 like protein，Ero1-Lα)以調節(jié)型的方式分泌到細胞外。通過這兩種方法旨在構建一種以三聚體、六聚體和多聚體為主的新型雙功能融合蛋白，從而增加腫瘤壞死因子受體Ⅱ與TNFα的親和力;同時利用富含“GC”的真核載體快速高效表達蛋白，初步探索了無血清懸浮流加培養(yǎng)的方法，為

3、進一步優(yōu)化快速、高效表達相關融合蛋白的大規(guī)模無血清懸浮流加培養(yǎng)工藝奠定了良好的基礎。
　　方法：
　　1.獲取ERP44和sTNFRⅡ-linker-adiponectin基因
　　①通過逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)，從人脂肪組織中獲得脂聯(lián)素cDNA，以該cDNA為模板，通過PCR得到ERP44基因。
　?、谝詫嶒炇冶４娴膒MH3-sTNFRⅡ-adiponectin為模板，分別擴增基因sTNFRⅡ和adi

4、ponectin，再將連接肽(linker，ACG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGAGGC AGC GGC GGG GGC GGA TCC GGC GAA TTC)和這兩段基因進行融合，得到sTNFRⅡ-linker-adiponectin基因。
　　2.構建表達質粒pCA-ERP44和pMH3-sTNFRⅡ-linker-adiponectin
　　通過PCR和重組PCR技術分別擴增目的基因ERP44

5、和sTNFRⅡ-linker-adiponectin，將pCA、pMH3載體分別進行雙酶切，再通過ClonExpress(@)Ⅱ One Step Cloning Kit(一步法無縫克隆試劑盒)進行連接、轉化，得到pCA-ERP44和pMH3-sTNFRⅡ-linker-adiponectin質粒。
　　3.建立ERP44高表達的sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44) CHO-S細胞株
　　先通過電轉

6、的方法，將成功構建的表達質粒轉染至CHO-S細胞中，經G418篩選得到高表達sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT融合蛋白的細胞株。再通過電轉的方法，將pCA-ERP44表達質粒轉入CHO-S細胞中，經嘌呤霉素篩選得到在細胞內穩(wěn)定高效表達sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT融合蛋白的細胞株。通過PPARγ激活劑的作用增加sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)融合蛋白的多聚化和分泌，以便獲得更

7、高表達量、更高活性的融合蛋白。本文有關的sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)融合蛋白指的均是指在ERP44和羅格列酮作用下表達出來的融合蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT。
　　4.建立高效表達sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白的CHO-S細胞株
　　通過電轉的方法，將構建成功的表達質粒轉染至CHO-S細胞中，經過G418篩選得到穩(wěn)定高效表達sTNFRⅡ-l

8、inker-adiponectin融合蛋白的細胞株。
　　5.sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)和sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白的獲取
　　5.1貼壁培養(yǎng)
　?、俳浛股睾Y選（先用G418篩選，再用嘌呤霉素篩選）出的高表達細胞株于T75平皿中貼壁培養(yǎng)，通過PPARγ激活劑（羅格列酮）增加脂聯(lián)素的轉錄和蛋白的分泌，PPARγ激活后能誘導Ero1-Lα表達，然后Ero

9、1-Lα與ERP44結合，促使被滯留在細胞內的高分子量脂聯(lián)素分泌到細胞外。最后通過收集細胞上清，利用鎳柱純化獲取目的蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)，透析過夜后用超濾管對蛋白進行濃縮，并通過Western-blot、考馬斯亮藍染色法來鑒定目的蛋白大小。
　?、趯⒑Y選出高效表達目的蛋白的細胞株于T75中貼壁培養(yǎng)，收集細胞上清，利用鎳柱純化獲取目的蛋白sTNFRⅡ-linker-adiponectin

10、，透析過夜后用超濾管對目的蛋白進行濃縮，并通過Western-blot、考馬斯亮藍染色法來鑒定目的蛋白大小。
　　5.2懸浮培養(yǎng)初探
　　將T75中貼壁培養(yǎng)的高表達目的蛋白的細胞株用B001培養(yǎng)基進行懸浮馴化，得到適合懸浮生長的穩(wěn)定高效表達目的蛋白的工程細胞株。
　　6.sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)和sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白活性的測定
　　通過C

11、CK-8試劑盒檢測目的蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)和sTNFRⅡ-linker-adiponectin中和TNF-α殺傷L929細胞的活性，比較目的蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)、 sTNFRⅡ-linker-adiponectin、sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT和標準品sTNFRⅡ-Fc拮抗TNFα的能力的差異。
　　結果：
　　1

12、.成功得到了ERP44和sTNFRⅡ-linker-adiponectin基因
　　①以人脂聯(lián)素的cDNA為模板進行PCR，用1％的瓊脂糖檢測結果，成功得到與預期條帶大小一致的片段。
　?、趯CR得到的基因sTNFRⅡ、adiponectin和linker進行重疊PCR，用1％的瓊脂糖檢測結果，成功得到與預期條帶大小一致的片段。
　　2.成功構建質粒了pCA-ERP44和pMH3-sTNFRⅡ-linker-adip

13、onectin
　　提取質粒并進行酶切，用1％的瓊脂糖鑒定酶切結果，得到與預期大小相符的條帶，將該質粒送測序鑒定目的基因，與NCBI上獲取的基因序列比對后完全一致，提示成功構建pCA-ERP44和pMH3-sTNFRⅡ-linker-adiponectin。
　　3.在ERP44高表達的CHO-S細胞株中成功表達出了融合蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)
　　通過電轉的方法，將pCA-E

14、RP44表達質粒轉染至CHO-S細胞中，經嘌呤霉素(puromycin)篩選得到在細胞內高表達sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)融合蛋白的細胞株。經PPARγ激活劑（羅格列酮）處理后，對細胞內sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)融合蛋白的表達起到一定調控的作用。
　　4.成功在CHO-S細胞中表達出了sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白
　　電轉后的

15、細胞經G418加壓篩選后，通過Dot-Blot篩選出高表達細胞株，經過3輪抗生素篩選后，挑選表達量較高的細胞株進行擴增培養(yǎng)，得到了高效表達目的蛋白的細胞株。
　　5.sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)和sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白的純化
　　鎳柱純化時，目的蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)和sTNFRⅡ-linker-adiponec

16、tin的咪唑洗脫濃度分別在130mM和235mM左右，純化后成功得到目的蛋白。經過WB鑒定，目的蛋白的單體大小均在70kDa左右，并且以多聚體的形式存在為主。
　　6.sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)和sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白活性的測定
　　sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)和sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白

17、均具有顯著抑制TNFα殺傷L929細胞的活性，且隨蛋白濃度的升高，抑制TNFα殺傷L929細胞越明顯。結果表明目的蛋白活性均強于標準品sTNFRⅡ-Fc和實驗室保存的蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT。
　　結論：
　　本實驗成功構建了質粒pCA-ERP44，通過PPARγ激活劑（羅格列酮）增加了脂聯(lián)素的轉錄和目的蛋白的分泌，PPARγ被激活后可以誘導Ero1-Lα表達，然后Ero1-Lα與ERP44結合，

18、能促使被滯留在細胞內的高分子量脂聯(lián)素分泌到細胞外。同時在CHO-S細胞中也得到了目的蛋白表達，并篩選出了高表達目的蛋白的單克隆細胞株。收取細胞上清，經鎳柱純化獲得具有一定體積并測得具有較好活性的融合蛋白。
　　同時本實驗成功構建了sTNFRⅡ-linker-adiponectin真核表達載體，在CHO-S細胞中也檢測到了目的蛋白表達，并且篩選出高效穩(wěn)定表達目的蛋白的細胞株。收取細胞上清，經鎳柱純化后也得到了一定體積的目的蛋白并測得