擬南芥ABA誘導(dǎo)側(cè)根減少突變體的篩選與基因克隆.pdf

1、側(cè)根作為擬南芥胚后發(fā)育的重要器官，在擬南芥根構(gòu)型建立中起著重要的作用。盡管植物自身營養(yǎng)水平及外界生物、非生物環(huán)境條件對側(cè)根的發(fā)生都有影響，但是目前對這些因素特別是ABA(脫落酸)影響植物側(cè)根生成的分子機(jī)理還知之甚少。因此對ABA調(diào)控側(cè)根發(fā)育的分子機(jī)理研究及關(guān)鍵基因的克隆意義重大。本研究是在設(shè)定ABA脅迫條件下對側(cè)根形成和發(fā)育相關(guān)突變體進(jìn)行篩選，經(jīng)過大量的篩選，得到表型比較穩(wěn)定的與ABA調(diào)控根構(gòu)型有關(guān)的突變體4種。本文著重研究了其中1個T

2、-DNA插入突變體，該突變體在ABA脅迫條件下側(cè)根少于野生型(該突變體命名為raa2-1)。通過TAIL-PCR方法，我們得知了RAA2基因的信息，同時我們從salk種子庫上查到了該基因的另一個T-DNA插入的突變體材料，并要到了該突變體，命名為raa2-2。
　　 通過對突變體表型、遺傳分析以及基因克隆和簡單的功能分析，我們得到以下主要研究結(jié)果：(1)通過對280種T-DNA插入突變體(左建儒實(shí)驗(yàn)室惠贈)和40種EMS誘變的突

3、變體(實(shí)驗(yàn)室提供)，進(jìn)行在設(shè)定ABA脅迫條件下篩選，最終得到表型比較穩(wěn)定的與ABA調(diào)控根構(gòu)型有關(guān)的突變體4種，分別是t237，t245，e28，e45。在MS(含1.2％瓊脂)培養(yǎng)基上，這四種突變體的表型都表現(xiàn)為與野生型無明顯差異；在含5μMABA的MS(含1.2％瓊脂)培養(yǎng)基上，這四種突變體的側(cè)根數(shù)量都要比野生型(WT)Columbia(Col-0)的側(cè)根數(shù)量少。(2)RAA2功能缺失突變導(dǎo)致在外源5μMABA存在的條件下，突變體側(cè)根

4、的形成受ABA抑制程度更大。用不同種類、不同濃度的糖處理突變體，它們的根系表型與野生型的根系表型則沒有明顯差異。(3)0.5μMABA和1μMABA處理的萌發(fā)實(shí)驗(yàn)顯示，突變體的萌發(fā)率比野生型的萌發(fā)率低，它們對ABA更敏感。失水和紅外實(shí)驗(yàn)顯示，突變體的氣孔開度比野生型的氣孔開度大。(4)遺傳分析表明，突變體為單基因隱形突變。利用TAIL-PCR方法克隆了RAA2基因。RAA2基因定位在第1條染色體上。對基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析得知其所編碼的

5、蛋白是一個具有多個跨膜結(jié)構(gòu)域的膜蛋白，該膜蛋白屬于LrgB-like家族，且與細(xì)菌中的lrgAB操縱子同源，都具有兩個保守結(jié)構(gòu)域LrgA和LrgB，目前該膜蛋白功能未知。突變體raa2-1，其T-DNA插入位點(diǎn)位于第二個外顯子內(nèi)。突變體raa2-2，其T-DNA插入位點(diǎn)位于第一個內(nèi)含子內(nèi)。(5)對RAA2基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示兩個突變體中RAA2基因均被敲除。同時我們構(gòu)建了該基因的回補(bǔ)載體和超表達(dá)載體，以便進(jìn)一步了解RAA2基