AMPK-Cnrk1在里氏木霉纖維素酶基因表達調(diào)控中的功能研究.pdf

1、里氏木霉（Trichoderma reesei）是工業(yè)生產(chǎn)纖維素酶的模式菌株，其外切葡聚糖酶CBH1占其分泌總纖維素酶系的60％。cbh1基因的表達受到碳源的嚴格調(diào)控:纖維素存在時其表達量可提高1000倍以上，而葡萄糖條件下其表達則完全被抑制，即存在葡萄糖阻遏效應(yīng)(又稱碳代謝抑制carbon cataboliterepression，CCR)。
　　AMPK(AMP-activated protein kinase)是一種保守的異

2、源三聚體蛋白質(zhì)激酶，存在于大多數(shù)真核細胞中，其酶活力能夠被AMP上調(diào)。在釀酒酵母碳代謝抑制中AMPK通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄抑制因子Mig1的活性起作用。在里氏木霉的CCR過程中與Mig1起相似作用的蛋白為Cre1。但研究表明，在多細胞的絲狀真菌中AMPK的作用可能與在酵母中的有所不同。里氏木霉的AMPK可以將酵母Mig1的絲氨酸活性位點磷酸化但對自身Cre1無此作用;在Aspergillus nidulans中CreA與AMPK沒有相互作用。另外

3、，該激酶可以通過Snf1和Rgt2/Snf3系統(tǒng)影響葡萄糖信號感應(yīng);在轉(zhuǎn)錄水平影響包括轉(zhuǎn)錄激活因子和轉(zhuǎn)錄抑制因子的磷酸化、核染色質(zhì)的修飾、RNA PolⅡ的活性、細胞質(zhì)mRNA的穩(wěn)定性、乙酰輔酶A的平衡和組蛋白的乙酰化在內(nèi)的多個基因調(diào)控步驟;在轉(zhuǎn)錄后水平通過抑制主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Gcn4的翻譯從而間接在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)編碼氨基酸生物合成酶基因的表達。
　　綜上所述，由于AMPK在絲狀真菌CCR中的作用有別于酵母并且可以通過多種途徑影響

4、碳源代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，那么在里氏木霉中對纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是否有影響？因此，本論文針對上述問題，對里氏木霉中編碼其同源蛋白的基因cnrk1進行了敲除并構(gòu)建了具有不同Cnrk1激酶活性的突變株，以研究該蛋白在維素酶基因誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄中可能的作用和機制。取得的主要成果如下:
　　一、通過同源性驗證，證明了里氏木霉Cnrk1和釀酒酵母AMPK存在功能差異，并證明蛋白C端的低保守性可能是引起這種差異的主要原因
　　為了驗證二者的同源

5、性，首先構(gòu)建了里氏木霉Cnrk1缺失菌，一方面將酵母AMPK全蛋白基因及其超活性突變體AMPKG53R的基因回補到里氏木霉Cnrk1缺失菌中，在1％ Avicel誘導(dǎo)時纖維素酶的產(chǎn)生并不能恢復(fù)到野生型TU6水平;另一方面將里氏木霉Cnrk1全蛋白及其通過氨基酸突變得到的一系列突變體的系列基因回補到酵母AMPK缺失菌MCY4908中也沒有彌補蔗糖利用缺陷;而將里氏木霉Cnrk1-N端和釀酒酵母AMPK-C端融合回補到MCY4908中則使其

6、恢復(fù)了蔗糖利用能力。因此我們認為里氏木霉Cnrk1和釀酒酵母AMPK存在功能上的差異，且這種差異可能是由于蛋白C端保守性較低引起的。
　　二、通過里氏木霉Δcnrk1突變株的表型測定證明了該基因在碳源利用、菌絲體生長、孢子存活率及纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要功能
　　以里氏木霉野生型TU6為出發(fā)菌株構(gòu)建了Δcnrk1突變株，實驗證明該菌株對包括葡萄糖在內(nèi)的各種碳源的利用能力下降;顯微鏡觀察結(jié)果顯示突變株菌絲體比野生型較小;4℃

7、存放條件下孢子的存活率大大降低;與酵母AMPK缺失表型不同的是，里氏木霉細胞壁的完整性和抗逆性等壓力響應(yīng)過程并沒有受到影響。1％ Avicel誘導(dǎo)條件下突變株主要的纖維素酶CBH1表達量和pNPC酶活升高，且這種升高是由于cbh1基因在轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)引起的。
　　三、通過Cnrk1不同活性突變體的回補，證明該蛋白在里氏木霉纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄中起負調(diào)控因子的作用
　　與TU6相比，Cnrk1G18R突變株對各種碳源的利用能力減弱

8、，并且喪失了利用Avice1和Lactose的能力，在0.5％ xylan誘導(dǎo)條件下可以生長但胞外蛋白濃度和木聚糖酶活與TU6相比有減弱。因此我們得出結(jié)論:Cnrk1作為負調(diào)控因子在Avicel和Lactose誘導(dǎo)途徑中起顯著作用而對Xylan誘導(dǎo)途徑影響較小。
　　四、通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到與里氏木霉Cnrk1相互作用的蛋白
　　通過酵母雙雜交系統(tǒng)我們篩選到13種可能與里氏木霉Cnrk1相互作用的蛋白:AMPKβ亞基，A