Wolbachia感染對(duì)雄果蠅繁殖力的影響機(jī)理研究.pdf

1、Wolbachia是普遍存在于節(jié)肢動(dòng)物和絲狀線蟲體內(nèi)的胞內(nèi)共生菌，它通過(guò)雌性卵的細(xì)胞質(zhì)傳遞給子代。目前已有研究表明，在全球范圍內(nèi)約有70％的昆蟲種類受到Wolbachia的感染。Wolbachia主要位于節(jié)肢動(dòng)物的生殖組織中，它能誘導(dǎo)宿主生殖方式發(fā)生多種改變，比如精卵細(xì)胞質(zhì)不親和(CI)、雌性化、孤雌生殖和殺雄等，其中CI是Wolbachia引起的最普遍的一種表型，即感染W(wǎng)olbachia的雄性宿主與未感染或感染不同品系Wolbachi

2、a的雌性宿主交配后，胚胎孵化率很低甚至全部死亡。細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在CI胚胎中，雄性原核發(fā)育滯后，與雌性原核發(fā)育不同步，最終導(dǎo)致胚胎死亡。由于Wolbachia分布廣泛，且對(duì)宿主的生殖方式產(chǎn)生多種影響，因此它已成為最有潛力的媒介昆蟲和農(nóng)業(yè)害蟲生物防治的工具。Wolbachia的研究，尤其是CI機(jī)制的研究以及Wolbachia對(duì)媒介昆蟲宿主影響的研究已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一。關(guān)于CI的分子機(jī)制，雖然已經(jīng)有了部分的研究報(bào)道，但其確切的

3、機(jī)制還未知。我們研究組從Wolbachia感染對(duì)果蠅精子育性的角度來(lái)研究CI的分子機(jī)制。
　　 本研究組前期以Wolbachia感染和未感染的果蠅三齡幼蟲精巢為研究對(duì)象，采用microarray技術(shù)得到感染和未感染W(wǎng)olbachia果蠅精子發(fā)生早期差異表達(dá)至少1.5倍的基因296個(gè)。本研究首先從這些差異表達(dá)的基因中挑選了7個(gè)差異倍數(shù)較大、且可能與生殖相關(guān)的基因(CG8627-RA、CG9081-RA、CG5320-RC、CG12

4、052-RP、CG17934-RA、CG17268-RA和CG7929-RA)，通過(guò)定量RT-PCR(qRT-PCR)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了體內(nèi)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)CG8627-RA、CG9081-RA和CG5320-RC的表達(dá)由于Wolbachia感染發(fā)生了上調(diào)，而CG12052-RP、CG17934-RA、CG17268-RA和CG7929-RA等基因的表達(dá)由于Wolbachia感染發(fā)生了下調(diào)，這與microarray的結(jié)果一致。其中CG8627-R

5、A和CG12052-RP在Wolbachia感染和未感染的果蠅精巢中的表達(dá)水平具極顯著差異(P＜0.01)；而CG9081-RA、CG17934-RA和CG17268-RA的表達(dá)具顯著差異(P＜0.05)；另外兩個(gè)基因CG5320-RC和CG7929-RA差異不顯著(P＞0.05)。
　　 由于在microarray分析和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中，CG3767(JHI-26)基因在Wolbachia感染的精巢中都顯示上調(diào)表達(dá)，且上調(diào)

6、的倍數(shù)很高。該基因編碼的保幼激素誘導(dǎo)蛋白26最近又被鑒定為黑腹果蠅的一個(gè)精子蛋白，而CG17934-RA(Mst84Db)在雄性生殖系中特異表達(dá)，且與精子的移動(dòng)有關(guān)，因此，本研究對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)一步做了原位雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示JHI-26和Mst84Db在Wolbachia感染和未感染的果蠅三齡幼蟲精巢中都普遍表達(dá)，但是JHI-26在感染W(wǎng)olbachia的精巢中的表達(dá)量比未感染的高，而Mst84Db的表達(dá)情況卻相反，即在感染W(wǎng)olbach

7、ia的精巢中的雜交信號(hào)比未感染的要弱。這正表明這兩個(gè)基因確實(shí)是在果蠅幼蟲精巢中表達(dá)，且Wolbachia感染導(dǎo)致JHI-26在果蠅早期精巢中表達(dá)上調(diào)，卻使得Mst84Db在果蠅早期精巢中表達(dá)下調(diào)。前人的研究發(fā)現(xiàn)，幼蟲發(fā)育期快的Wolbachia感染的雄果蠅，其引起的CI強(qiáng)度越高(胚胎孵化率很低)，而幼蟲發(fā)育期較長(zhǎng)的Wolbachia感染雄果蠅引起的CI強(qiáng)度越低。由于JHI-26是保幼激素(JH)特異誘導(dǎo)的一種蛋白，因此Wolbachia

8、可能模擬了JH的功能誘導(dǎo)了JHI-26的大量表達(dá)，高水平的JHI-26可能抑制了幼蟲階段精巢的發(fā)育，幼蟲期發(fā)育最快的雄性果蠅產(chǎn)生了未完全成熟的精子，使得受精后雄性原核發(fā)育滯后，導(dǎo)致雌雄原核發(fā)育不同步，最終導(dǎo)致胚胎死亡。
　　 由于CG12052(lola)參與多種生物學(xué)過(guò)程，如與軸突生長(zhǎng)和定向、免疫反應(yīng)、滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡、腦的形態(tài)建成、性腺的發(fā)育等有關(guān)。已有研究表明，在lola突變果蠅中，滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡過(guò)程受阻，在lola突變果蠅卵巢

9、程序性細(xì)胞死亡過(guò)程中，染色質(zhì)不能完全濃縮。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在Wolbachia感染的幼蟲精巢中，lola-rp基因的表達(dá)是顯著下調(diào)的，因此lola-rp可能在精子發(fā)生過(guò)程中起重要作用。為了進(jìn)一步分析lola-rp在果蠅發(fā)育過(guò)程中的作用，我們對(duì)下調(diào)顯著的lola-rp做了時(shí)空表達(dá)分析。組織特異性分析結(jié)果顯示，lola-rp在果蠅的腦和卵巢中高表達(dá)，在成體精巢中也有一定量的表達(dá)，而在幼蟲階段表達(dá)量較低，表明其可能在腦的發(fā)育以及生殖細(xì)胞的發(fā)

10、生過(guò)程中起作用。此外，在胚胎發(fā)育過(guò)程中，從3h胚胎開始就檢測(cè)到lola-rp的表達(dá)，且在整個(gè)胚胎期都維持在較高水平，說(shuō)明黑腹果蠅lola-rp可能是母源性基因，且在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　 為了深入研究Mst84Db的功能，我們體外合成了Mst84Db的雙鏈RNA，再對(duì)未感染W(wǎng)olbachia雄性果蠅進(jìn)行顯微注射，利用RNAi技術(shù)對(duì)雄性體內(nèi)Mst84Db基因的表達(dá)進(jìn)行干擾。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)4-6d的雄蠅注射dsRNA后

11、，Mst84Db基因的表達(dá)水平發(fā)生下調(diào)，在注射dsRNA24h后就起到了干擾的效果，注射后72小時(shí)，基因敲降幅度最大。與對(duì)照組相比，基因敲降后的雄蠅繁殖能力顯著下降，與未感染W(wǎng)olbachia的雌性果蠅交配后胚胎孵化率顯著低于對(duì)照組，這與CI現(xiàn)象類似。另外，對(duì)未孵化胚胎的表皮進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，表皮上沒(méi)有體節(jié)的出現(xiàn)，說(shuō)明未孵化胚胎停滯于胚胎發(fā)育的早期。因此，Wolbachia感染可能抑制了精子發(fā)生過(guò)程中Mst84Db基因的轉(zhuǎn)錄，從而使精子正常