肺炎支原體對四環(huán)素類耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、【目的】:
　　肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae,Mp）是最常見的呼吸道感染病原菌之一，人群普遍易感。肺炎支原體是我國社區(qū)獲得性肺炎（community acquired pneumonia,CAP）的首位致病菌[1,2]，經(jīng)常出現(xiàn)大規(guī)模暴發(fā)流行（平均每2-6年出現(xiàn)一次全球流行），近年來還出現(xiàn)越來越多的危重病例[3-5]。肺炎支原體的抗生素選擇方案主要有三大類：大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類和四環(huán)素類。大環(huán)內(nèi)酯類作為首

2、選抗生素，近年耐藥率不斷上升，我國以92％的耐藥率高居世界之首[6]。如何預(yù)防肺炎支原體對其他兩種抗生素產(chǎn)生耐藥性變得極其重要。從2001年Okazaki N等人第一次公開報道肺炎支原體對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥[7]，到2009年我國出現(xiàn)92%耐藥率的報道，中間僅僅相隔了不到十年的時間。雖然還沒有肺炎支原體對喹諾酮臨床耐藥的報道，但在其他人類支原體中[8,9]已經(jīng)分離到喹諾酮類的臨床耐藥株，國內(nèi)外也都已有用喹諾酮類體外誘導(dǎo)肺炎支原體耐藥成功的報

3、道[10,11]。加之喹諾酮類因為其對骨骼發(fā)育的影響而禁用于18歲以下人群，四環(huán)素類成為8-18歲人群耐大環(huán)內(nèi)酯類肺炎支原體感染的唯一選擇。四環(huán)素目前在臨床與體外均未出現(xiàn)過耐藥的報道。本實驗旨在收集臨床樣本，篩查臨床對四環(huán)素耐藥的肺炎支原體株，同時進(jìn)行體外誘導(dǎo)耐藥。通過對臨床與誘導(dǎo)耐藥兩者耐藥機(jī)制的探討，對臨床用藥進(jìn)行指導(dǎo)，避免或者延緩肺炎支原體對四環(huán)素類抗生素產(chǎn)生耐藥。
　　【方法】:
　　1.本課題組已在2010-201

4、4年期間從某醫(yī)院呼吸科門診和病房從患者的呼吸道標(biāo)本中培養(yǎng)和分離獲得了數(shù)十株肺炎支原體株，建立了肺炎支原體菌株庫，本實驗從該菌株庫中復(fù)蘇肺炎支原體株；用肺炎支原體肉湯培養(yǎng)法與肺炎支原體瓊脂培養(yǎng)法交替?zhèn)鞔垣@得純化的肺炎支原體菌株。同時繼續(xù)從臨床收集咽拭子、肺泡灌洗液等呼吸道標(biāo)本，用實時定量PCR與肉湯培養(yǎng)法繼續(xù)鑒定、分離、培養(yǎng)新的肺炎支原體株。
　　2.用96孔板肉湯微量稀釋法對肺炎支原體進(jìn)行藥敏檢測，若肺炎支原體對四環(huán)素類MIC≥

5、8μg/mL時，判斷為肺炎支原體對四環(huán)素類耐藥。
　　3.對敏感株進(jìn)行誘導(dǎo)耐藥，在含有低于抑菌濃度抗生素的培養(yǎng)基中逐代培養(yǎng)，直至肺炎支原體株產(chǎn)生耐藥。
　　4.對耐藥株進(jìn)行添加外排泵抑制劑利血平和碳酰氰基-對-氯苯腙（CCCP）的藥敏實驗，觀察外排泵抑制劑對MIC值的影響，排查耐藥株中是否存在外排泵。
　　5.對耐藥株和敏感株進(jìn)行全基因測序，篩查耐藥株中是否含有核糖體保護(hù)蛋白基因、外排泵基因、滅活酶基因或其他耐藥基因，

6、并進(jìn)行靶區(qū)（16S rRNA）序列的比對分析。
　　6.核糖體與四環(huán)素結(jié)合力實驗：用同位素3H（氚）標(biāo)記四環(huán)素，將同位素標(biāo)記的四環(huán)素分別與敏感株和誘導(dǎo)耐藥株（已驗證16S rRNA靶位突變）的核糖體孵育結(jié)合，將孵育液濾過GF/C濾膜（Whatman），再用5 mL緩沖液洗膜3次，濾膜80℃烤干后置于1 mL閃爍液中過夜。使用液體閃爍計數(shù)儀(Tricarb9100型，美國PE公司)測量CPM值（count per minute）。<

7、br>　　7.對敏感株與耐藥株進(jìn)行蛋白雙向電泳，通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，尋找敏感株與耐藥株間的差異蛋白，鑒定是否含有與四環(huán)素耐藥相關(guān)的功能蛋白。
　　【結(jié)果】:
　　1.共成功復(fù)蘇33株肺炎支原體株，共收集臨床樣本132份，實時定量PCR檢測肺炎支原體陽性樣本12份（9.1%），但未從臨床分離獲得新的肺炎支原體株。
　　2.藥敏結(jié)果顯示肺炎支原體對四環(huán)素類全部敏感，其中替加環(huán)素MIC值相對較低，顯示出比一、二代四環(huán)素及喹

8、諾酮類更好的抗菌活性，肺炎支原體對左氧氟沙星全部敏感，對紅霉素耐藥率54.8%。
　　3.在含四環(huán)素類的培養(yǎng)基中持續(xù)傳代，共獲得8株對四環(huán)素類耐藥（MIC≥8μg/mL）的誘導(dǎo)耐藥株，所有經(jīng)歷過四環(huán)素類誘導(dǎo)的菌株，MIC值均較誘導(dǎo)前有顯著升高，并且對其他四環(huán)素有交叉耐藥。
　　4.外排泵抑制劑利血平可以將部分菌株對四環(huán)素、米諾環(huán)素及替加環(huán)素的MIC值降低4倍以上，碳酰氰基-對-氯苯腙（CCCP）對耐藥株MIC值未發(fā)現(xiàn)明顯類似

9、作用。
　　5.全基因組測序提示8株誘導(dǎo)耐藥株中，6株存在16S rRNA1173位點A→T突變；另外2株同時存在964位點T→C、1169位點G→A的點突變。所有的敏感株均未檢測到以上位點的改變。以上位點的突變僅出現(xiàn)在耐藥株中，且以上位點的突變位于四環(huán)素的結(jié)合靶區(qū)。另外，使用ResFinder2.1在全基因組序列中查找耐藥基因，在所有誘導(dǎo)耐藥株中均未發(fā)現(xiàn)核糖體保護(hù)蛋白基因、外排泵基因和滅活酶基因及其他與四環(huán)素耐藥相關(guān)的耐藥基因。

10、
　　6.靶位結(jié)合力實驗顯示，誘導(dǎo)耐藥株的核糖體比敏感株核糖體對四環(huán)素的結(jié)合力明顯減低。
　　7.建立了用蛋白雙向電泳對肺炎支原體蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究的實驗方法。在S63敏感株與誘導(dǎo)耐藥株中共選取19個差異蛋白點進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果未發(fā)現(xiàn)與耐藥直接相關(guān)的功能蛋白。但發(fā)現(xiàn)在耐藥株中，與蛋白轉(zhuǎn)錄合成相關(guān)的蛋白（如分子伴侶蛋白、轉(zhuǎn)錄延長因子GreA等）表達(dá)增多，在敏感株中，與能量代謝有關(guān)的蛋白（丙酮酸脫氫酶、烯醇酶等）表達(dá)增多。

11、　　【結(jié)論】:
　　1.本研究未發(fā)現(xiàn)臨床對四環(huán)素類耐藥的肺炎支原體；
　　2.四環(huán)素類藥物可誘導(dǎo)肺炎支原體耐藥，且可呈交叉耐藥；
　　3.首次獲得8株對四環(huán)素類耐藥的肺炎支原體的全基因序列并上傳Genbank；
　　4.誘導(dǎo)耐藥株中尚未發(fā)現(xiàn)外排泵基因、核糖體保護(hù)基因和滅活酶基因；
　　5.肺炎支原體對四環(huán)素類誘導(dǎo)耐藥最有可能的機(jī)制是靶區(qū)突變；
　　6.靶位結(jié)合力實驗提示16S rRNA靶區(qū)點突變可以降