犬弓首蛔蟲(chóng)卵黃原蛋白基因的克隆、表達(dá)及組織分布研究.pdf

1、弓首蛔蟲(chóng)?。═oxocariasis）主要是由犬弓首蛔蟲(chóng)（Toxocara canis, T. canis）寄生于宿主小腸而引起的一類(lèi)寄生蟲(chóng)病。該病具有世界性分布的特點(diǎn)，有數(shù)據(jù)顯示，世界各地T. canis的感染率為0.9％~64.7%。其感染性蟲(chóng)卵不僅可以感染犬，還可以感染多種動(dòng)物及人類(lèi)，能引起眼睛幼蟲(chóng)移行癥（Ocular larva migrans, OLM）、神經(jīng)幼蟲(chóng)移行癥（Nerve larvae migration, NLM）

2、、隱秘幼蟲(chóng)移行癥（Cryptic larval migration, CLM）和內(nèi)臟幼蟲(chóng)移行癥（Visceral larva migrans, VLM），導(dǎo)致嚴(yán)重的病理綜合征。因此，該病在獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)上具有十分重要的意義。
　　卵黃原蛋白（Vitellogenin, Vg）是脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員之一，通常是在卵生非哺乳動(dòng)物的卵巢外組織中合成，經(jīng)卵黃原蛋白受體（Vitellogenin receptor, VgR）介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)

3、入卵巢，分解為卵黃蛋白（Yolk protein, YP）、卵黃脂磷蛋白（Lipovitellin, Lv）、卵黃高磷蛋白（Phosvitin, Pv）等功能性物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，Vg不僅為胚胎發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)元素，還具有促進(jìn)動(dòng)物卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化、粒子載體、生物標(biāo)志物、抗氧化活性、免疫防御等多種生理功能。隨著秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans）卵黃原蛋白基因的發(fā)現(xiàn)，陸續(xù)展開(kāi)了對(duì)有齒食道口線(xiàn)蟲(chóng)（Oesophagosto

4、mum dentatum）、捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)（Haemonchus contortus）、毛圓線(xiàn)蟲(chóng)（Trichostrongylus vitrinus）等寄生蟲(chóng)卵黃原蛋白的相關(guān)研究，而有關(guān)犬弓首蛔蟲(chóng)Vg的研究還未見(jiàn)報(bào)道。
　　本論文在實(shí)驗(yàn)室已有的T. canis轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，對(duì)犬弓首蛔蟲(chóng)卵黃原蛋白(T. canis-vg, Tc-vg)基因進(jìn)行了克隆、原核表達(dá)和組織定位等相關(guān)研究。主要試驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1. Tc-vg基因

5、的生物信息學(xué)分析
　　運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)Tc-vg基因進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示該基因?yàn)橐粋€(gè)完整的編碼區(qū)序列（Coding sequence, CDS），大小為5082 bp，可編碼1694個(gè)氨基酸；理論分子質(zhì)量為198 kDa，等電點(diǎn)為6.19。信號(hào)肽在線(xiàn)預(yù)測(cè)顯示其N(xiāo)端含有一個(gè)信號(hào)肽，裂解位點(diǎn)在18-19 aa處。由在線(xiàn)軟件分析顯示該蛋白在一級(jí)結(jié)構(gòu)上以親水性為主；含有三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：Vitellogenin_N、DUF1943(do

6、main of unknown function)以及vWD(von Willebrand factor type D domain)。二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲。在線(xiàn)分析TcVg磷酸化位點(diǎn)顯示該蛋白中存在三種主要的磷酸化氨基酸，即磷酸化蘇氨酸（pThr）、磷酸化酪氨酸（pTyr）和磷酸化絲氨酸（pSer）共44個(gè)，分別為7、19、18。亞細(xì)胞定位分析為分泌通路；功能預(yù)測(cè)顯示參與脂質(zhì)分子的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。根據(jù)Blast比對(duì)發(fā)

7、現(xiàn)Tc-vg與豬蛔蟲(chóng)（Ascaris suum）、美洲鉤蟲(chóng)（Necator americanus）和小桿線(xiàn)蟲(chóng)（Caenorhabditis briggsae）的相似性高達(dá)100%；系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示Tc-vg與A. suum(ERG83573)的親緣關(guān)系最近；與N. americanus(XP_013298422)、線(xiàn)蟲(chóng)（ Pristionchus pacificus, KKA71696)、十二指腸鉤蟲(chóng)（ Ancylostoma duod

8、enale, KIH69020）、捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)（ Haemonchus contortus, CDJ93502）、胎生網(wǎng)尾線(xiàn)蟲(chóng)（Dictyocaulus viviparus, KJH46366）等的親緣關(guān)系次之。
　　2. Tc-vwd與Tc-duf1943結(jié)構(gòu)域的克隆
　　運(yùn)用PCR技術(shù)，克隆獲得了Tc-vg基因的兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域（ Tc-duf1943和Tc-vwd）。其中，Tc-vwd結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度為834 bp，ORF長(zhǎng)度

9、為816 bp，編碼272 aa，預(yù)測(cè)蛋白分子量大小為31.15 kDa，等電點(diǎn)為5.12。犬弓首蛔蟲(chóng)vWD(T. canis-vWD, TcvWD)蛋白主要參與發(fā)病機(jī)理的生物學(xué)過(guò)程。Tc-duf1943結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度為882 bp， ORF大小為864 bp，編碼288 aa，預(yù)測(cè)成熟蛋白分子量為33.25 kDa，等電點(diǎn)為9.57。犬弓首蛔蟲(chóng)DUF1943（T. canis-DUF1943, TcDUF1943）蛋白主要具有脂質(zhì)定位和有

10、機(jī)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)纳飳W(xué)過(guò)程。
　　3. Tc-vwd/pET28a與Tc-duf1943/pET28a表達(dá)載體的構(gòu)建及原核表達(dá)
　　按照 TaKaRa公司的質(zhì)粒提取試劑盒的說(shuō)明對(duì) Tc-vwd/pMD19-T、Tc-duf1943/pMD19-T和pET28a等質(zhì)粒進(jìn)行提取，酶切之后目的基因與pET28a進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α細(xì)胞，平板培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單個(gè)白色菌落培養(yǎng)，PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒

11、Tc-vwd/pET28a與Tc-duf1943/pET28a轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)表達(dá)菌，挑取單菌落培養(yǎng)，當(dāng)OD600值達(dá)到0.6~1.0時(shí)，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)對(duì)菌液進(jìn)行IPTG濃度梯度和時(shí)間梯度的優(yōu)化，篩選最佳的誘導(dǎo)條件。結(jié)果顯示重組蛋白TcvWD與TcDUF1943均以包涵體形式存在，其中TcvWD大小約為40 kDa，TcDUF1943大小約為35 kDa；TcvWD蛋白于37℃，0.4 mM的IPT

12、G誘導(dǎo)6 h時(shí)表達(dá)量最高，TcDUF1943在37℃，0.4 mM的IPTG誘導(dǎo)4h時(shí)表達(dá)量最高。
　　4. TcvWD多克隆抗體的制備及Western blot檢測(cè)
　　對(duì)Tc-vwd/pET28a/BL21進(jìn)行大量表達(dá)，離心收集包涵體沉淀，8 M尿素溶解，純化上清，將重組蛋白TcvWD免疫新西蘭白兔，2-3周免疫一次，共免疫四次，當(dāng)效價(jià)大于1:50000時(shí)進(jìn)行最終采血制備抗血清，對(duì)所得抗體進(jìn)行效價(jià)、濃度、純度測(cè)定。結(jié)果顯

13、示TcvWD融合蛋白純度較高，所得抗體效價(jià)為1:512000，濃度為0.82 mg/ml，純度合格。Western blot顯示TcvWD能夠與免疫抗血清反應(yīng)，而不與免疫前血清反應(yīng)，即TcvWD具有良好的特異性，可用于免疫組化試驗(yàn)。
　　5. Tc-vg特異性表達(dá)和TcVg免疫組織化學(xué)分析
　　運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）方法檢測(cè)Tc-vg基因的組織差異表達(dá)