右美托咪定對大鼠海馬神經(jīng)元缺氧復氧損傷的作用及其機制.pdf

1、腦缺血是腦部組織血流量不足的一種疾病，這種情況通?？梢詫е履X組織的代謝率以及能量的降低，和隨之引起來的局部區(qū)域的腦梗死。當腦缺血這種情況發(fā)生時，由于來自于血液的氧以及營養(yǎng)物的供給減少，可能使腦部的神經(jīng)元組織產(chǎn)生饑餓感。饑餓可以誘導細胞產(chǎn)生凋亡，它有兩個轉(zhuǎn)移方向，一是往好的方向轉(zhuǎn)化：即恢復生存，二是往壞的方向轉(zhuǎn)化：即進入死亡。從病理生理學上來講，再灌注損傷通常發(fā)生在缺血期后血液供應重新返回腦組織時。與缺血性損傷相比，局部缺血/再灌注（I/

2、R）可能是引起線粒體呼吸鏈反應的破壞以及腦部組織腦損傷區(qū)域中炎性介質(zhì)的過量產(chǎn)生以及包漿中的Ca2+離子大量沉積從而對神經(jīng)元造成的更多的損害；在臨床外科上，有包括急性缺血性中風以及急性創(chuàng)傷性腦損傷等很多種腦部疾病，都可以引起缺血以及再灌注損傷。再灌注損傷在臨床上被認為是繼發(fā)性腦損傷的重要因素。
　　線粒體在調(diào)節(jié)細胞生命活動過程中起著重要的作用，它在細胞中以較高的速度不停的運動著，通過自我分裂或者彼此間相互融合，實現(xiàn)新個體的產(chǎn)生，并可

3、以在細胞中形成一種緊密的聯(lián)系。線粒體通常被人們稱作“細胞動力工廠”，其分裂和融合是否平衡，影響著功能和結(jié)構(gòu)的變化。經(jīng)過以前的研究表明，線粒體可以減少細胞色素C、以及調(diào)亡蛋白AFI因子等的表達,從而在細胞的程序性死亡中起著重要的調(diào)控作用。我們通過對大鼠短暫性腦I/R損傷模型的分析表明，線粒體分裂的多少與細胞凋亡的程度有著密切的關聯(lián)，抑制線粒體的分裂能夠減輕腦皮質(zhì)部分的I/R損傷。另外，有研究證實:線粒體的分裂過程中，鈣信號通路可以對線粒體

4、分裂相關蛋白Drpl的磷酸化與去磷酸化產(chǎn)生影響,進而對線粒體的分裂起到調(diào)控作用；因此如果減少線粒體攝取鈣離子的量，就可以降低線粒體的分裂能力，減少分裂線粒體的分裂次數(shù);在我們以前的實驗中也曾發(fā)現(xiàn)，降低MCU活性，對腦梗死面積及自由氧產(chǎn)生有一定的抑制作用,減輕線粒體腫脹損傷。這點在大鼠短暫性I/R損傷模型中得到了很好的體現(xiàn)。
　　右美托咪定是一種通過選擇性激動發(fā)揮其作用的鎮(zhèn)靜劑以及鎮(zhèn)痛劑，主要作用于α2腎上腺素受體。以前的研究已經(jīng)證

5、明過，右美托咪定可防止缺血再灌注損傷誘導的對心肌，腎，腸，肝，肺以及腦的損傷。同時Kuhmonen等人發(fā)現(xiàn)右美托咪定能夠?qū)Υ笫笾心X動脈閉塞引起的腦梗死有很大的益處。右美托咪定還可以減少炎性介質(zhì)誘導的Ca2+釋放以及鈣超載減少炎癥的繼續(xù)進展。最新研究表明右美托咪定可以抑制氧糖剝奪或者Ca2+誘導線粒體腫脹而保持線粒體形態(tài)與功能的穩(wěn)定，抑制海馬神經(jīng)元鈣超載，減少鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的激活，進而抑制線粒體分裂，其機制可能是通過抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的活

6、性，減少其對Drp1-ser637的磷酸化，進而抑制Drp1的轉(zhuǎn)位，減少與線粒體外膜蛋白Fis1的結(jié)合；另外，它還可以抑制Drp1-ser637與Fis1的表達，減少它們在線粒體外膜的共定位結(jié)合，從而抑制線粒體分裂的啟動。凋亡是I/R誘導的神經(jīng)元損傷中的主要途徑。線粒體在涉及細胞凋亡調(diào)節(jié)的內(nèi)在途徑中起重要作用。I/R誘發(fā)引起來炎癥因子可以引起線粒體的結(jié)構(gòu)和功能異常，導致CytC從線粒體釋放到細胞質(zhì)中和隨后級聯(lián)激活半胱天冬酶-9，-3和-

7、6，進而引起相關的凋亡級聯(lián)反應，Caspase-3的激活是線粒體凋亡必須經(jīng)歷的過程，它通過與其他家族成員的級聯(lián)反應，可以加速細胞的凋亡。因此我們就假設右美托咪定可以通過抑制鈣超載來減少線粒體分裂、保持線粒體形態(tài)與功能的穩(wěn)定，進而通過抑制線粒體-細胞色素C-半胱氨酸蛋白酶凋亡途徑，來減少神經(jīng)元細胞的凋亡，從而發(fā)揮腦保護作用。
　　目的：探討右美托咪定在大鼠海馬神經(jīng)元缺氧復氧損傷中的作用，以及右美托咪定對線粒體分裂的的影響。
　

8、　方法：新生24h之內(nèi)的SD大鼠，斷頭分離大腦海馬區(qū)神經(jīng)組織，收集獲得神經(jīng)元細胞進行原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)，培養(yǎng)至第8天，氧糖剝奪法建立海馬神經(jīng)元缺氧復氧模型，按照隨機數(shù)字表法將其隨機分為6組：:空白對照組(C組)，細胞未給予任何處理；賦形劑組（V組），賦形劑二甲基亞砜（DMSO)，終濃度為0.01%]加入細胞培養(yǎng)基；缺氧復氧組（H/R組）；右美托咪定組：D1、D2、D3組，在細胞缺氧復氧期間分別加入右美托咪定0.1、1、10μmol/L。

9、分組處理之后，用細胞增殖與毒性檢測試劑盒檢測各組細胞活性（確定右美托咪定合適的濃度范圍）、用透射電鏡觀察線粒體的超微結(jié)構(gòu)、用激光共聚焦顯微鏡觀察各組神經(jīng)元細胞質(zhì)Ca2+熒光強度、用ELISA法檢測細胞鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性、用Western-blot檢測Drp1、Fis1、Cyt C、capase3蛋白的表達。用流式細胞學檢測神經(jīng)元細胞的凋亡率。
　　結(jié)果：與對照組比較，H/R組的細胞數(shù)目以及活性顯著減少，與 H/R組比較，右美托咪定

10、組（D1、D2、D3）細胞數(shù)量相對增加，并且D2組的細胞活性比D1和D3相對要高。與對照組相比，H/R組的細胞凋亡率顯著增多，與 H/R組比較，右美托咪定組（D1、D2、D3）細胞凋亡率相對降低，并且D2組的細胞凋亡率比D1和D3相對要低。與對照組相比，神經(jīng)元Ca2+熒光強度、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性及Drp1、Fis1、Cyt C、caspase3蛋白的表達升高（P＜0.05）；與H/R組比較，D1、D2、D3組神經(jīng)元活性增強、線粒體超微結(jié)

11、構(gòu)破壞明減輕，神經(jīng)元Ca2+熒光強度、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性及Drp1、Fis1、Cyt C、caspase3的表達均降低（P＜0.05）；D2組又較D1、D3組細胞活性增強，細胞質(zhì)Ca2+熒光強度、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性及Drp1、Fis1、Cyt C、caspase3的表達均降低（P＜0.05）。
　　結(jié)論:右美托咪定0.1、1、10μmol/L可以明顯改善大鼠海馬神經(jīng)元在缺氧復氧中的損傷，其中1μmol/L是最佳的保護濃度，其機制可