甲氨蝶呤聯(lián)合環(huán)磷酰胺對IL-6介導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血淋巴細(xì)胞P-糖蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜異常增生、炎性細(xì)胞浸潤以及軟骨或骨的破壞為特點(diǎn)的慢性自身免疫病。目前改善病情抗風(fēng)濕藥(disease-modifying anti-rheumatic drugs， DMARDs）多藥耐藥性(multiple drug resistance，MDR）的產(chǎn)生是影響RA治療的新的關(guān)鍵因素。眾多研究發(fā)現(xiàn)ABC跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族所介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)藥物排出增加是多藥耐藥性產(chǎn)生的主

2、要機(jī)制之一，其中ABC跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員ABCB1即多藥耐藥基因1（MDR1）編碼的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）參與了眾多DMARDs藥物的排出。
　　我科依據(jù)細(xì)胞增殖動力學(xué)原理，采用甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）周期聯(lián)合環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）作為治療RA的新方法，20年的臨床實(shí)踐及系列臨床與基礎(chǔ)研究證實(shí)其遠(yuǎn)期療效明顯好于單用藥組及其他聯(lián)合方案，可延緩甚至部分逆

3、轉(zhuǎn)骨質(zhì)破環(huán)，且不良反應(yīng)少，安全性高。我們的前期耐藥研究已經(jīng)證實(shí)：1.RA患者各實(shí)驗(yàn)組外周血淋巴細(xì)胞中P-gp表達(dá)水平升高與RA難治程度相關(guān)，且與炎性指標(biāo)（血沉、C-反應(yīng)蛋白）及疾病活動度（DAS28）相關(guān)，證實(shí)了其參與了多藥耐藥的形成。2.在不同治療組P-gp表達(dá)水平的比較中，聯(lián)合用藥組較單用藥組P-gp表達(dá)水平減少，MTX/LEF周期聯(lián)合CTX一定程度逆轉(zhuǎn)P-gp表達(dá)。3.在IL-6刺激后，RA患者外周血淋巴細(xì)胞上P-gp的表達(dá)和功能

4、均明顯增強(qiáng)，并且呈一定的時間及濃度依賴性。4.IL-6通過ERKl／2、JAK2-STAT3信號通路調(diào)控RA患者外周血淋巴細(xì)胞 P-gp的表達(dá)和功能。目前MTX聯(lián)合CTX逆轉(zhuǎn)P-gp的表達(dá)的具體機(jī)制尚不明確，其逆轉(zhuǎn)耐藥是否與IL-6介導(dǎo)的JAK2-STAT3通路有關(guān)？是本課題的科學(xué)問題。
　　JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要由三個成分組成，即酪氨酸激酶相關(guān)受體、酪氨酸激酶（Janus Kinase，JAK)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子

5、（Signal transducers and activators of transcription，STAT）。多種細(xì)胞因子共用該信號傳導(dǎo)通路參與細(xì)胞的分化、增殖、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等多種重要的生物學(xué)功能。其中JAK2-STAT3是JAK-STAT家族的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并且參與了RA的病理生理過程。本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，探究RA患者M(jìn)TX聯(lián)合CTX逆轉(zhuǎn)P-gp的表達(dá)是否與JAK2-STAT3通路有關(guān)，明確MTX聯(lián)合CTX逆轉(zhuǎn)P-

6、gp表達(dá)的具體作用機(jī)制。
　　目的：
　　通過在體外RA外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入IL-6、不同濃度的MTX、CTX的體外活性物質(zhì)4-氫過氧環(huán)磷酰胺（4-Hydroperoxycyclophosphamide，4-HC）共培養(yǎng)72h，觀察各組淋巴細(xì)胞P-gp、JAK2、STAT3的表達(dá)情況，明確MTX聯(lián)合CTX逆轉(zhuǎn)IL-6介導(dǎo)P-gp表達(dá)的具體作用機(jī)制。
　　方法：
　　選取未經(jīng)任何DMARDs及生物制劑治療R

7、A患者15例。用肝素抗凝管采集入組患者外周血20ml，提取外周血淋巴細(xì)胞，建立淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系，分為空白組、IL-6組、MTX低+IL-6組、MTX中+IL-6組、MTX高+IL-6組、CTX+IL-6組、MTX低+CTX+IL-6組，置于37℃5％C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血淋巴細(xì)胞 P-gp的表達(dá)水平，RT-PCR方法檢測外周血淋巴細(xì)胞P-gp、JAK2、STAT3的mRNA水平。
　　結(jié)果：
　　

8、1.流式細(xì)胞術(shù)檢測各RA培養(yǎng)組外周血淋巴細(xì)胞P-gp表達(dá)水平：與空白對照組相比，IL-6組P-gp表達(dá)水平明顯升高（P<0.01）；與IL-6組相比，各處理組P-gp表達(dá)均降低，MTX高+IL-6組、CTX+IL-6組、MTX低+CTX+IL-6組降低差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且MTX低+CTX+IL-6組降低最明顯（P<0.01）；MTX低+CTX+IL-6組較MTX低+IL-6組降低差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

9、　　2. RT-PCR檢測各RA培養(yǎng)組外周血淋巴細(xì)胞P-gp mRNA水平：與空白對照組相比，IL-6組P-gp mRNA水平明顯升高（P<0.01）；與IL-6組相比，各處理組P-gp mRNA水平均降低，MTX高+IL-6組、CTX+IL-6組、MTX低+CTX+IL-6組降低差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且MTX低+CTX+IL-6組降低最明顯（P<0.01）；MTX低+CTX+IL-6組較MTX低+IL-6組降低差異有統(tǒng)計學(xué)

10、意義（P<0.05）。
　　3. RT-PCR檢測各RA培養(yǎng)組外周血淋巴細(xì)胞JAK2、STAT3 mRNA水平：與空白對照組相比，IL-6組JAK2、STAT3 mRNA水平明顯升高（P<0.01）；與IL-6組相比，各處理組JAK2、STAT3 mRNA均降低，MTX高+IL-6組、CTX+IL-6組、MTX低+CTX+IL-6組降低差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且MTX低+CTX+IL-6組降低最明顯（P<0.01）；MT