內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因DDIT3調(diào)控腫瘤細(xì)胞自噬與凋亡的分子機(jī)制研究.pdf

1、癌癥已成為人類最主要的致死疾病之一，嚴(yán)重威脅著人類的壽命。我國(guó)的腫瘤發(fā)病情況更是不容樂(lè)觀。根據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《全球癌癥報(bào)告2014》，2012年全世界共新增1400萬(wàn)癌癥病例并有820萬(wàn)人死亡。其中，中國(guó)新增307萬(wàn)癌癥患者并造成約220萬(wàn)人死亡，分別占全球總量的21.9％和26.8％。肺癌仍然是全世界發(fā)病率和致死率最高的癌癥，2012年新增肺癌病例180萬(wàn)，死亡人數(shù)159萬(wàn)，其中中國(guó)因肺癌死亡的的人數(shù)超過(guò)全世界的1/3。化學(xué)療法是

2、目前治療癌癥的重要手段之一，然而臨床上應(yīng)用的化療藥物還存在著副作用強(qiáng)和引發(fā)耐藥性等問(wèn)題，因此尋找安全高效的化療藥物就顯得尤為重要。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成、折疊與分泌的重要細(xì)胞器。內(nèi)源或外源的刺激會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)折疊功能紊亂所引起的一種細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)通過(guò)非折疊蛋白反應(yīng)來(lái)清除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的錯(cuò)誤折疊蛋白并維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)。如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激無(wú)法逆轉(zhuǎn)，會(huì)引起細(xì)胞功能惡化進(jìn)而引起細(xì)胞的死亡。越來(lái)越多的證據(jù)表

3、明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在多種腫瘤中廣泛存在，并與腫瘤細(xì)胞的存活和耐藥性密切相關(guān)。因此，針對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路設(shè)計(jì)和開發(fā)抗腫瘤靶向性藥物成為目前研究的熱點(diǎn)。
　　細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡是調(diào)控腫瘤細(xì)胞命運(yùn)的兩個(gè)重要過(guò)程，但二者之間的關(guān)系尚不清楚。在腫瘤細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激既可通過(guò)細(xì)胞自噬影響細(xì)胞的存活或死亡，又可直接誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)如何通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的自噬和凋亡來(lái)決定細(xì)胞的命運(yùn)尚不完全清楚。因此，探討腫瘤細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)細(xì)胞自噬和

4、細(xì)胞凋亡的影響具有重要的理論意義，并且在靶向化療藥物的設(shè)計(jì)和開發(fā)上具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是由未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積累所引起的。其中未折疊蛋白能使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶HSPA5和與其結(jié)合的三種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受器蛋白EIF2AK3、ERN1和ATF6解離，進(jìn)而該三種跨膜蛋白得以激活。激活后的ERN1通過(guò)非常規(guī)形式對(duì)XBP1前體mRNA的一段26nt的內(nèi)含子進(jìn)行剪切，剪切后的mRNA發(fā)生翻譯框移碼，編碼成為具有轉(zhuǎn)錄

5、活性的轉(zhuǎn)錄因子X(jué)BP1S(Xboxbindingprotein1splicing)。XBP1S作為轉(zhuǎn)錄因子可以上調(diào)參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性蛋白降解途徑(ERassociateddegradation，ERAD)的相關(guān)基因的表達(dá)，以調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)蛋白質(zhì)質(zhì)量的控制和維持氧化還原狀態(tài)平衡。同時(shí)，ERN1還可以招募TRAF2和ASK1基因以激活p38MAPK和JNKMAPK信號(hào)通路。EIF2AK3通過(guò)介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起始因子EIF2A的磷酸化進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)翻譯而

6、使細(xì)胞進(jìn)入暫時(shí)的“靜止期”。在這種情況下，轉(zhuǎn)錄因子ATF4以不依賴帽狀結(jié)構(gòu)的方式進(jìn)行選擇性的翻譯，上調(diào)參與維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的基因的表達(dá)。從HSPA5釋放后，ATF6轉(zhuǎn)移至高爾基體，由高爾基體蛋白酶S1P(site1protease)和S2P(site2protease)進(jìn)行切割。被切割的片段作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)參與ERAD和維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的幾個(gè)相關(guān)基因的表達(dá)。在UPR過(guò)程中，DDIT3是UPR的3個(gè)感受器共同的靶基因，即ERN1、ATF6和E

7、IF2AK3均可以上調(diào)CHOP表達(dá)。
　　DDIT3最早作為一個(gè)C/EBPs的成員被鑒定出來(lái)，發(fā)揮著C/EBPs的顯性負(fù)抑制劑的作用。DDIT3又被稱GADD153、CHOP和C/EBPζ。C/EBPs作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族對(duì)多種基因進(jìn)行調(diào)控，這些基因廣泛參與免疫功能、細(xì)胞分化和細(xì)胞增殖等生理學(xué)過(guò)程。目前為止，已經(jīng)鑒定出6個(gè)C/EBP家族成員，分別為:C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPγ、C/EBPδ、C/EBPε和DDIT3。

8、DDIT3與C/EBP家族其他成員或JUN/FOS家族成員形成異源二聚體，從而作為轉(zhuǎn)錄因子參與在應(yīng)激過(guò)程中誘導(dǎo)表達(dá)的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。DDIT3蛋白含有兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域:一個(gè)N端轉(zhuǎn)錄激活域(transactivitydomain)和一個(gè)C端的堿性-亮氨酸拉鏈(basicleucinezipper，bZIP)結(jié)構(gòu)域。已有的文獻(xiàn)證實(shí)，DDIT3作為轉(zhuǎn)錄因子既可介導(dǎo)BBC3和BCL2L11的轉(zhuǎn)錄，又可介導(dǎo)TNFRSF10B的轉(zhuǎn)錄從而參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

9、誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程。而最近的研究表明，DDIT3還可以對(duì)許多自噬相關(guān)基因進(jìn)行間接或直接調(diào)控（如DDIT3作為轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)節(jié)TRIB3和ATG5的表達(dá)參與細(xì)胞自噬），從而參與由細(xì)胞自噬介導(dǎo)的促存活過(guò)程。因此，DDIT3可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬這兩個(gè)相互拮抗的生物過(guò)程之間的平衡進(jìn)而影響細(xì)胞的命運(yùn)。然而，DDIT3是否還存在其他誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的分子機(jī)制以及DDIT3誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡的關(guān)系等問(wèn)題尚不清楚。
　　因此，本研究課

10、題旨在探討和研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因DDIT3如何調(diào)控腫瘤細(xì)胞的自噬和凋亡;DDIT3所介導(dǎo)的細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系以及DDIT3介導(dǎo)的細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡對(duì)腫瘤細(xì)胞命運(yùn)的影響。以期為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)對(duì)細(xì)胞自噬和凋亡的調(diào)控機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，并為抗腫瘤的靶向化療藥物的設(shè)計(jì)和開發(fā)提供依據(jù)。
　　1.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因DDIT3調(diào)控腫瘤細(xì)胞自噬的分子機(jī)制研究
　　1.1DDIT3作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控腫瘤細(xì)胞自噬的分子機(jī)制研究

11、>　　Salinomycin（鹽霉素）是第一個(gè)通過(guò)高通量的篩選系統(tǒng)鑒定出的能特異性殺死腫瘤干細(xì)胞的化合物。該化合物能選擇性的殺死乳腺癌及其他腫瘤干細(xì)胞，但其具體的分子機(jī)制尚不清楚。因而了解其作用機(jī)制對(duì)于研究腫瘤干細(xì)胞特性、腫瘤耐藥及開發(fā)新型抗腫瘤藥物具有重要的意義。在人的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn):(1)Salinomycin能明顯上調(diào)MAP1LC3B蛋白的表達(dá);(2)Salinomycin能誘導(dǎo)代表自噬小體的熒光亮點(diǎn)聚集;(3)通過(guò)

12、siRNA干擾技術(shù)抑制自噬相關(guān)基因ATG5和ATG7的表達(dá)或利用自噬早期抑制劑（3-MA或LY294002）抑制自噬流后，Salinomycin誘導(dǎo)的MAP1LC3B的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)并且熒光亮點(diǎn)明顯減少;(4)利用自噬晚期抑制劑(bafilomycinA1或chloroquine)抑制自噬流后，Salinomycin誘導(dǎo)的MAP1LC3B的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)并且熒光亮點(diǎn)明顯增加。這些結(jié)果證實(shí)，在人的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，Salinomyc

13、in誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬。我們?cè)谶M(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)Salinomycin誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān):(1)Salinomycin能明顯上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白ERN1、p-EIF2A、ATF4和DDIT3的表達(dá)，并能誘導(dǎo)XBP1mRNA的切割;(2)利用siRNA技術(shù)抑制ATF4和DDIT3后，Salinomycin誘導(dǎo)的MAP1LC3B蛋白表達(dá)明顯下調(diào);(3)利用化合物4-PBA抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)程后，Salinomycin誘導(dǎo)的MAP1L

14、C3B蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。通過(guò)對(duì)Salinomycin誘導(dǎo)細(xì)胞自噬分子機(jī)制進(jìn)一步的研究，我們證實(shí)Salinomycin通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制MTOR通路，即ATF4-DDIT3/CHOP-TRIB3-AKT1-MTOR通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。此外，我們還發(fā)現(xiàn)在人的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，Salinomycin誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬對(duì)促進(jìn)細(xì)胞存活具有重要的作用。另外，為了證實(shí)Salinomycin在腫瘤干細(xì)胞樣的細(xì)胞中是否存在相同的機(jī)制，我們利用A549細(xì)

15、胞構(gòu)建了能穩(wěn)定抑制E-cadherin基因CDH1表達(dá)的A549/shCDH1細(xì)胞系。我們發(fā)現(xiàn)Salinomycin在A549/shCDH1細(xì)胞中同樣能通過(guò)ATF4-DDIT3/DDIT3-TRIB3-AKT1-MTOR通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬;同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)A549/shCDH1細(xì)胞對(duì)Salinomycin更為敏感，這表明通過(guò)抑制細(xì)胞自噬對(duì)腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行靶向治療可能是最有希望的策略之一。總之，我們的這些發(fā)現(xiàn)表明利用Salinomycin聯(lián)合細(xì)

16、胞自噬抑制劑可能是殺死腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的一種有效的治療手段。
　　1.2DDIT3通過(guò)與ATG5相結(jié)合調(diào)控腫瘤細(xì)胞自噬的分子機(jī)制研究
　　DDIT3作為轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控TRIB3或ATG5的表達(dá)間接或直接誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，但對(duì)于DDIT3是否還存在其他誘導(dǎo)自噬的途徑尚不清楚。在本課題中，我們發(fā)現(xiàn)DDIT3通過(guò)三個(gè)方面對(duì)ATG5進(jìn)行調(diào)節(jié)進(jìn)而調(diào)控自噬過(guò)程:1）我們?cè)贏549、H157、H1792和293FT細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)DDIT3能

17、上調(diào)ATG5的表達(dá)，與最近的文獻(xiàn)報(bào)道一致，即DDIT3作為ATG5的轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)ATG5的表達(dá);2）我們通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)DDIT3可以與ATG5、ATG12-ATG5復(fù)合物及ATG16L1相結(jié)合，并且免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，在細(xì)胞質(zhì)中DDIT3與ATG5及ATG16L1存在共定位現(xiàn)象;另外，通過(guò)GSTpull-down實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)DDIT3能促進(jìn)ATG12-ATG5復(fù)合物與ATG16L1的結(jié)合以形成ATG12-ATG5-ATG16

18、L1復(fù)合體，進(jìn)而促進(jìn)自噬小體的形成;(3)根據(jù)已有的文獻(xiàn)報(bào)道，鈣網(wǎng)蛋白Calpain可在ATG5的Thr193進(jìn)行剪切，形成24kD和9kD兩個(gè)片段，24kD的ATG5片段會(huì)轉(zhuǎn)移至線粒體外膜上進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在本課題中，我們發(fā)現(xiàn)DDIT3可與ATG5的C端的區(qū)域（194-274aa）結(jié)合，并且當(dāng)DDIT3過(guò)表達(dá)時(shí)可明顯抑制由doxorubicin或TG誘導(dǎo)的鈣蛋白酶calpain對(duì)ATG5的剪切;另外，我們發(fā)現(xiàn)DDIT3可以減緩ATG

19、5的降解的降解速度，進(jìn)而維持ATG5的穩(wěn)定。此外，我們初步探討了ATG5也可對(duì)DDIT3進(jìn)行調(diào)控-1）我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)ATG5過(guò)表達(dá)時(shí)可明顯抑制DDIT3的降解速度，進(jìn)而維持DDIT3的穩(wěn)定性;(2)我們發(fā)現(xiàn)在A549細(xì)胞中，TG、cisplatin、doxorubicin及etoposide可誘導(dǎo)ATG5從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中并增強(qiáng)了DDIT3對(duì)TNFRSF10A和TNFRSF10B的反式激活作用?？傊?，在本課題中我們首次揭示了DDIT3可

20、通過(guò)促進(jìn)ATG5的表達(dá)、抑制其降解和促進(jìn)ATG12-ATG5-ATG16復(fù)合體的形成等三個(gè)方面參與對(duì)自噬的調(diào)控，并且我們首次初步探討了ATG5對(duì)DDIT3的調(diào)控。這些發(fā)現(xiàn)將豐富我們對(duì)DDIT3調(diào)控自噬和凋亡的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)。ATG5和DDIT3之間的相互調(diào)控可能是促進(jìn)細(xì)胞自噬與凋亡之間串?dāng)_的新機(jī)制。
　　2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因DDIT3調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究
　　2.1DDIT3通過(guò)上調(diào)TNFRSF10A和TNFRS

21、F10B的表達(dá)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究
　　腫瘤壞死因子受體超家族成員10a（TNFRSF10A，又稱DR4或TRAIL-R1）和腫瘤壞死因子受體超家族成員10b（TNFRSF10B，又稱DR5或TRAIL-R2）是兩種細(xì)胞表面受體，可與腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)結(jié)合從而介導(dǎo)外源凋亡途徑。已有的文獻(xiàn)證實(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑可通過(guò)TNFRSF10A和TNFRSF10B介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。大量文獻(xiàn)證實(shí)，DDIT3可以作

22、為轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控TNFRSF10B的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而上調(diào)TNFRSF10B的表達(dá)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而，對(duì)TNFRSF10A的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制尚不清楚。在本課題中，我們利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑TG和Tm處理人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、H460和H1792后發(fā)現(xiàn):(1)DDIT3和TNFRSF10A的表達(dá)均明顯上調(diào)，且DDIT3的表達(dá)上調(diào)時(shí)間較TNFRSF10A要早些;(2)DDIT3過(guò)表達(dá)后TNFRSF10A的表達(dá)明顯增加;(3)利用siRNA干擾

23、技術(shù)抑制DDIT3表達(dá)后，TNFRSF10A的表達(dá)明顯減少。這些結(jié)果證實(shí)DDIT3可調(diào)控TNFRSF10A的表達(dá)。為證實(shí)DDIT3是否作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控TNFRSF10A的轉(zhuǎn)錄，我們預(yù)測(cè)并證實(shí)在TNFRSF10A啟動(dòng)子區(qū)存在兩個(gè)假定的DDIT3結(jié)合位點(diǎn)(-1636/-1625;-371/-364)和一個(gè)假定的AP-1結(jié)合位點(diǎn)(-304/-298)。通過(guò)螢光素酶活性實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)在三個(gè)假定的結(jié)合位點(diǎn)中AP-1結(jié)合位點(diǎn)的功能最為活躍。而且，我

24、們發(fā)現(xiàn)在TNFRSF10A啟動(dòng)子區(qū)的AP-1結(jié)合位點(diǎn)（-304/-298）區(qū)域，DDIT3可以和phospho-JUN直接結(jié)合從而形成DDIT3/phospho-JUN異源二聚體。此外，我們發(fā)現(xiàn)一種重要的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶KAT2A和DDIT3存在物理性結(jié)合。為了探究KAT2A是否也參與TNFRSF10A/B的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，我們進(jìn)行了3個(gè)實(shí)驗(yàn)并發(fā)現(xiàn):(1)利用siRNA干擾技術(shù)抑制KAT2A的表達(dá)后TNFRSF10A/B的表達(dá)會(huì)明顯下調(diào);(2

25、)利用螢光素酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)在KAT2A表達(dá)抑制時(shí)TNFRSF10A/B啟動(dòng)子的活性明顯下調(diào);(3)通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)KAT2A可能參與了KAT2A/DDIT3/phospho-JUN復(fù)合體或KAT2A/DDIT3復(fù)合體的形成，KAT2A可能通過(guò)乙?；疕3K9/K14進(jìn)而促進(jìn)TNFRSF10A/B的轉(zhuǎn)錄。此外，我們還證明了在人的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，TNFRSF10A參與了由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡