SIRT3在二甲雙胍改善髙脂培養(yǎng)肌細(xì)胞自噬和氧化應(yīng)激中的作用.pdf

1、二甲雙胍是目前治療2型糖尿病的一線藥物。其降糖的可能機(jī)制為通過(guò)抑制肝葡萄糖輸出，改善外周組織對(duì)胰島素的敏感性、增加對(duì)葡萄糖的攝取和利用而降低血糖。研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍一方面能夠改善氧化應(yīng)激，另一方面能夠增強(qiáng)自噬作用。但是其具體機(jī)制尚不明確。本研究擬通過(guò)觀察二甲雙胍在體外細(xì)胞水平對(duì)高脂誘導(dǎo)的L6成肌細(xì)胞自噬及氧化應(yīng)激的影響，探討其改善氧化應(yīng)激、增強(qiáng)自噬的機(jī)制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。
　　目的：研究SIRT3在二甲雙胍改善髙脂培養(yǎng)肌細(xì)胞

2、自噬及氧化應(yīng)激中的作用及其機(jī)制。
　　方法：采用髙脂（含0.4mmol/L棕櫚酸培養(yǎng)基）干預(yù)法建立骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗模型。復(fù)蘇L6成肌細(xì)胞，培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化為L(zhǎng)6肌細(xì)胞，隨機(jī)分為正常對(duì)照（Con）組和棕櫚酸（PA）組，24小時(shí)后分別測(cè)定培養(yǎng)基中葡萄糖濃度，判斷造模是否成功。造模成功后，實(shí)驗(yàn)分組如下，正常培養(yǎng)基對(duì)照組（Con）、高脂對(duì)照組（PA）、二甲雙胍培養(yǎng)基組（PA+Met）、棕櫚酸 siRNA陰性對(duì)照組（PA+siRNA）、棕

3、櫚酸 SIRT3敲低組（PA+siSIRT3）、二甲雙胍siRNA陰性對(duì)照組（PA+Met+siRNA）、二甲雙胍SIRT3敲低組（PA+Met+siSIRT3）。通過(guò)RT-PCR及Western Blot方法檢測(cè)SIRT3 mRNA及蛋白表達(dá)水平，確定轉(zhuǎn)染是否成功。采用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)志蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3Ⅱ）、p62、Beclin1的mRNA表達(dá)水平；Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、

4、p62、Beclin1、SIRT3的蛋白表達(dá)水平。相應(yīng)試劑盒測(cè)定各組肌細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，即超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性，還原型谷胱甘肽（GSH）、脂質(zhì)過(guò)氧化物酶（LPO）的含量；DHE熒光探針檢測(cè)各組肌細(xì)胞活性氧簇（ROS）的含量。多樣本間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析，兩樣本間比較采用t檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1.L6成肌細(xì)胞分化成功鑒定
　　與未分化組細(xì)胞相比，分化組細(xì)胞Desmin

5、、Myogenin的mRNA表達(dá)含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示L6成肌細(xì)胞分化成功；
　　2.L6成肌細(xì)胞IR體外模型的建立
　　采用0.4mmol/L棕櫚酸的培養(yǎng)基孵育細(xì)胞24小時(shí)后，PA組細(xì)胞內(nèi)葡萄糖濃度為20.46±1.52mmol/L，較Con組細(xì)胞內(nèi)葡萄糖濃度（14.36±1.38mmol/L）升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），提示胰島素敏感性下降，IR模型建立成功；
　　3.C

6、CK8法檢測(cè)藥物干預(yù)對(duì)肌細(xì)胞增殖的影響
　　與Con組相比，不同濃度PA組分別作用24h后，均能夠升高肌細(xì)胞抑制率，降低增殖率，最終選取0.4mmol/L為合適的PA濃度；與PA組相比，0.5、1.0、2.0mmol/L濃度的Met均使肌細(xì)胞增殖率增加，然而并沒(méi)有恢復(fù)至Con組水平，超過(guò)2mmol/L的Met濃度反而造成肌細(xì)胞增殖率下降，最終選取的合適的Met濃度為2mmol/L；
　　4.肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染鑒定
　　各組SI

7、RT3的表達(dá)：與Con組相比，PA組SIRT3 mRNA和蛋白表達(dá)顯著減少（P＜0.05）；與PA組相比，PA+Met組SIRT3 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯增加（P＜0.05）；與PA+siRNA組相比，PA+siSIRT3組肌細(xì)胞SIRT3 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）；與PA+Met+siRNA組相比，PA+Met+siSIRT3組肌細(xì)胞SIRT3 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05），表明SIRT3 siR

8、NA轉(zhuǎn)染成功；
　　5.肌細(xì)胞自噬水平
　　5.1.自噬相關(guān)指標(biāo)mRNA表達(dá)水平的變化
　　與Con組相比， PA組LC3Ⅱ、Beclin1 mRNA表達(dá)水平下降， p62 mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與PA組相比， PA+Met組干預(yù)后顯著上調(diào)LC3Ⅱ、Beclin1 mRNA表達(dá)，明顯減少p62 mRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與PA+siRNA組相比， PA+siSIR

9、T3組LC3Ⅱ mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步降低（P＜0.05），Beclin1 mRNA表達(dá)下降、p62 mRNA表達(dá)升高，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與PA+Met+siRNA組相比，PA+Met+siSIRT3組LC3Ⅱ、Beclin1 mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步降低，p62 mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；
　　5.2.自噬相關(guān)分子的蛋白表達(dá)水平變化
　　與Con組相比，PA組LC3

10、Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1/GAPDH均顯著降低， p62/GAPDH顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與PA組相比， PA+Met組干預(yù)后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1/GAPDH的比值明顯升高， p62/GAPDH明顯減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與PA+siRNA組相比，PA+siSIRT3組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低，Beclin1/GAPDH的蛋白表達(dá)下降、p62/GAPDH的蛋白

11、表達(dá)升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與PA+Met+siRNA組相比，PA+Met+siSIRT3組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1/GAPDH的蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低，p62/GAPDH的蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；
　　6.肌細(xì)胞氧化應(yīng)激
　　6.1.活性氧（ROS）含量
　　用DHE熒光探針?lè)跤鹘M細(xì)胞，熒光顯微鏡下的觀察結(jié)果顯示，與Con組相比，PA組細(xì)胞內(nèi)紅色熒光

12、的強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著升高；二甲雙胍組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯減弱，提示ROS生成減少。與PA+siRNA組相比，PA+siSIRT3組細(xì)胞內(nèi)的紅色熒光進(jìn)一步明顯增強(qiáng)；與PA+Met+siRNA組相比，PA+Met+siSIRT3組細(xì)胞內(nèi)ROS含量也進(jìn)一步增加；
　　6.2.SOD、CAT活性及GSH、LPO含量測(cè)定
　　L6肌細(xì)胞經(jīng)棕櫚酸刺激后，抗氧化酶SOD、CAT的活性較Con組均明顯下降（P＜0.05），

13、GSH含量明顯降低（P＜0.05），LPO含量明顯增加（P＜0.05）；PA+Met組LPO含量較PA組明顯減少（P＜0.05）， SOD活性、GSH含量明顯增加（P＜0.05），CAT活性增加（P＞0.05）。PA+siSIRT3組SOD的活性較PA+siRNA組進(jìn)一步明顯下降（P＜0.05）， LPO含量進(jìn)一步明顯增加（P＜0.05），CAT活性、GSH含量進(jìn)一步降低（P＞0.05）；PA+Met+siSIRT3組SOD、CAT的活

14、性較PA+Met+siRNA組進(jìn)一步明顯下降（P＜0.05），GSH含量進(jìn)一步降低（P＞0.05），LPO含量進(jìn)一步增加（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.髙脂孵育能夠降低肌細(xì)胞葡萄糖攝取率及胰島素敏感性，同時(shí)伴有SIRT3表達(dá)下降；二甲雙胍干預(yù)能夠改善肌細(xì)胞的胰島素抵抗程度，同時(shí)伴有SIRT3表達(dá)升高。
　　2.二甲雙胍能夠提高髙脂培養(yǎng)肌細(xì)胞內(nèi)自噬水平，減少ROS生成，恢復(fù)SOD、CAT等抗氧化酶的活性，提高GS