臍帶間充質(zhì)干細胞的分泌蛋白表達譜研究.pdf

1、背景與目的:
　　隨著對干細胞的研究不斷深入,臍帶間充質(zhì)干細胞在細胞替代治療、組織工程學、再生醫(yī)學領域取得了令人矚目的成就,對神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、生殖系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病及腫瘤疾病均具有很好的療效,已經(jīng)成為了一個很有發(fā)展力的治療工具,但其治療機制至今仍不完全清楚,然而臍帶間充質(zhì)干細胞具有很強的自分泌/旁分泌功能,其分泌的蛋白很有可能是其發(fā)揮治療作用的重要機制之一。
　　本實驗旨在從人臍帶中分離、培

2、養(yǎng)間充質(zhì)干細胞并對其檢測,建立一套臍帶間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及檢測體系;制備臍帶間充質(zhì)干細胞分泌上清,鑒定人臍帶間充質(zhì)干細胞的分泌蛋白并對分泌蛋白表達譜進行研究,為臍帶間充質(zhì)干細胞治療機制提供一定理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.采用植塊貼壁法從新生兒臍帶中分離、培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞,采用流式細胞術分析其表型,檢測其內(nèi)毒素含量和是否有支原體污染。
　　2.收集第三代人臍帶間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)上清,采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技

3、術獲得分泌上清中蛋白質(zhì)的質(zhì)譜圖,應用質(zhì)譜軟件對質(zhì)譜文件進行定性分析并與人類蛋白質(zhì)組質(zhì)譜標準品數(shù)據(jù)庫匹配;利用SignalP軟件進行分泌蛋白預測;把得到的分泌蛋白進行功能分類并通過基因本體分析(GO,Gene Ontology)了解其分子分子功能及生物學過程。
　　結果:
　　1.從新生兒臍帶中分離的臍帶間充質(zhì)干細胞呈長梭形、貼壁生長且增殖迅速,經(jīng)檢測其免疫表型CD75、CD90、CD105均大于99％,陰性表面標志CD45/

4、34/11b/19/HLA-DR為0.49%;內(nèi)毒素濃度小于0.25EU/ml;支原體檢測陰性。
　　2.通過液相色譜-質(zhì)譜共鑒定到共鑒定到236個分泌蛋白,其中114個為確定的分泌蛋白,122個為signalP預測的分泌蛋白。這些分泌蛋白在細胞生長、增殖、分化、凋亡、粘附、血管新生、血液循環(huán)、炎癥、抗菌、神經(jīng)營養(yǎng)、骨代謝、鈣磷平衡、抑制及促進腫瘤發(fā)生及進展等發(fā)面發(fā)揮作用。分別參與了15個生物學過程(按所占比例從高到低):代謝過程

5、、生物調(diào)節(jié)過程、發(fā)育過程、刺激反應、細胞通信、細胞粘附、細胞分化、細胞增殖、運輸、細胞運動、防御反應、細胞死亡、復制、細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、凝固;14種分子功能(按所占比例從高到低):蛋白結合活性、催化活性、金屬離子結合活性、信號轉(zhuǎn)導因子活性、受體活性、酶活性調(diào)節(jié)、核苷酸結合活性、分子活性、脫氧核糖核酸結合活性、載體活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性、核糖核酸結合活性、抗氧化活性、翻譯調(diào)節(jié)活性。
　　結論:
　　本實驗建立了一種較為理想的人臍帶間充質(zhì)