siRNA對(duì)體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞紅蛋白基因表達(dá)的抑制.pdf

1、細(xì)胞紅蛋白(CYGB)是繼脊椎動(dòng)物血紅蛋白,肌紅蛋白,腦紅蛋白之后所發(fā)現(xiàn)的第四類攜氧球蛋白,具有可逆性結(jié)合、運(yùn)輸及儲(chǔ)存氧的主要生物學(xué)功能,在缺氧缺血性損傷時(shí)表達(dá)增強(qiáng),并且可能發(fā)揮缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用。細(xì)胞紅蛋白的發(fā)現(xiàn)為缺氧缺血性腦損傷(HIBD)的發(fā)病機(jī)制及防治方案提供了新的切入點(diǎn)。RNA干擾(RNAi)技術(shù)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默技術(shù),被廣泛的應(yīng)用于基因功能、基因治療等基因水平的研究。它通過人為地引入與內(nèi)源靶基因

2、具有同源序列的雙鏈RNA(有義RNA和反義RNA),從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mRNA的降解,達(dá)到抑制基因表達(dá)的目的。各種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)21-23個(gè)nt的短雙鏈RNA,即siRNA,可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞組織內(nèi)引起基因封閉作用,其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定無須像反義核苷酸那樣進(jìn)行廣泛的化學(xué)修飾以提高其半衰期,并能在低于反義核苷酸幾個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度下,使靶基因降至極低水平甚至完全“敲除”。本實(shí)驗(yàn)以CYGB基因?yàn)榘袠?biāo),設(shè)計(jì)合成siRNA,并通過脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)海馬神

3、經(jīng)元中,研究其阻斷CYGB基因表達(dá)的效應(yīng),為進(jìn)一步研究CYGB的功能奠定基礎(chǔ)。
　　目的：轉(zhuǎn)染特異性針對(duì)細(xì)胞紅蛋白(CYGB)基因的 siRNA進(jìn)入體外培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元中,觀察其對(duì)CYGB基因表達(dá)的抑制作用。
　　方法：取新生大鼠(24小時(shí)內(nèi))海馬組織做神經(jīng)元原代培養(yǎng),神經(jīng)元特異性Neu免疫熒光抗體鑒定神經(jīng)元純度后,通過陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將體外化學(xué)合成的針對(duì)CYGB基因的3組siRNA(根據(jù)堿基序列不同,分別為siRN

4、A-78,siRNA-79,siRNA-80)轉(zhuǎn)入細(xì)胞中,以熒光對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染率估測(cè)轉(zhuǎn)染效率,以未轉(zhuǎn)入siRNA細(xì)胞為空白對(duì)照,轉(zhuǎn)入陰性siRNA(不與任何脊椎動(dòng)物基因具備同源性)細(xì)胞為陰性對(duì)照,通過 RT-PCR方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各組siRNA對(duì)CYGB基因mRNA表達(dá)的抑制作用。
　　結(jié)果：成功體外培養(yǎng)經(jīng)特異性Neu免疫熒光抗體鑒定純度較高的海馬神經(jīng)元;轉(zhuǎn)染熒光對(duì)照siRNA8小時(shí)后倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率在70％左右

5、;轉(zhuǎn)染3組siRNA(siRNA-78, siRNA-79,siRNA-80)0h,24h,48h,60h及72h后,RT-PCR結(jié)果提示轉(zhuǎn)染siRNA-7824h后CYGB基因mRNA表達(dá)量與空白對(duì)照(1.039±0.007)及陰性對(duì)照(1.038±0.005)比明顯減少,為1.021±0.009(P<0.01),48h后與空白對(duì)照(1.041±0.009)及陰性對(duì)照(1.035±0.007)比顯著減少,為0.942±0.008(P<

6、0.001),60h后與空白對(duì)照(1.033±0.003)及陰性對(duì)照(1.033±0.006)比明顯減少,為1.002±0.006(P<0.001),72h后表達(dá)無明顯差別(P>0.05)。轉(zhuǎn)染 siRNA-79,siRNA-80在各時(shí)間點(diǎn)與空白對(duì)照及陰性對(duì)照相比均沒有明顯差別(P>0.05)。
　　結(jié)論：特異性針對(duì)大鼠CYGB基因設(shè)計(jì)的siRNA轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元,短時(shí)間(24h-60h)內(nèi)能顯著下調(diào)CYGB基因的表達(dá),其