血清microRNA對持續(xù)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶正常慢性乙肝病毒感染者的診斷價值.pdf

1、我國肝臟疾病中慢性乙肝病毒（HBV）仍是主要病因，由于仍然缺乏根治乙肝病毒藥物，目前慢性乙型肝炎治療的總體目標(biāo)只能是最大限度地長期抑制 HBV，減輕肝細(xì)胞炎癥壞死及肝纖維化，延緩和減少肝臟失代償、肝硬化、HCC及其并發(fā)癥的發(fā)生，從而改善生活質(zhì)量和延長存活時間。對慢性乙肝治療適應(yīng)癥的判斷需依賴HBV病毒學(xué)指標(biāo)，生化學(xué)指標(biāo)甚至肝組織學(xué)檢查。
　　丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)被世界衛(wèi)生組織

2、推薦為肝功能損害最敏感的檢測指標(biāo)，也是各種指南關(guān)于慢性乙肝抗病毒治療和預(yù)后判斷的重要指標(biāo)。但近年來，不斷有持續(xù)ALT正常（persistently normal ALT,PNALT）慢性乙肝病毒感染者伴有明顯肝損傷的報道.甚至發(fā)展成肝硬化和肝細(xì)胞癌的報道。對這類慢性乙肝的特殊群體，由于報道的人群不同，樣本量相差大，掌握ALT正常的持續(xù)時間不同等原因，結(jié)果不一：有的報道認(rèn)為PNALT人群，肝組織損傷輕2％-3%；有的報道中度以上的肝纖維化

3、比率達(dá)49%(42/85)。對PNALT這個特殊人群，各種慢性乙肝防治指南均建議嚴(yán)密觀察和肝穿刺組織學(xué)檢查，但肝穿刺的有創(chuàng)性，標(biāo)本的局限性以及病理醫(yī)生的主觀差異性等問題，決定了肝穿刺難以被患者普遍接受，發(fā)展新的無創(chuàng)診斷技術(shù)以及尋找新的生物診斷標(biāo)志物一直是研究的熱點。
　　我們自2006年來長期關(guān)注PNALT慢性乙肝病毒感染者這一群體，積累的病例及生物標(biāo)本在2000例以上。本研究采用回顧前瞻性研究，試圖闡述以下問題：
　　一、

4、PNALT慢性乙肝感染者的臨床特點和病理特點，其影響因素？
　　二、除了病理診斷目前常用的無創(chuàng)性肝纖維化指標(biāo)（技術(shù)）對 PNALT慢性乙肝的診斷效應(yīng)如何？
　　三、血清miRNA具有生物標(biāo)志物特性，在顯著肝組織損傷的PNALT與不顯著肝組織損傷PNALT之間是否存在差異表達(dá)的miRNA?
　　四、如果存在差異的miRNA表達(dá)，可否進(jìn)一步篩選出用于診斷的miRNA組合？
　　第一部分持續(xù)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶正常的慢性乙

5、型肝炎病毒感染者的臨床、肝臟病理學(xué)特點及相關(guān)因素分析
　　目的:了解持續(xù)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶正常（PNALT）的慢性乙肝感染者的臨床及肝臟病理學(xué)特點。
　　方法:采用回顧-前瞻性連續(xù)觀察我院2006年8月至2013年12月的所有進(jìn)行過肝穿刺病理學(xué)檢查的慢性乙肝感染者，共入選2467例進(jìn)行過肝穿刺慢性乙肝病例，排除1210例。PNALT共589例，其中HBeAg陽性228例，HBeAg陰性，361例；持續(xù)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶間斷正常（

6、PIALT1）(ALT1-2ULN,n=386)，其中HBeAg陽性187例，HBeAg陰性，199例；PIALT2(ALT>2ULN,n=282)，其中HBeAg陽性156例，HBeAg陰性，126例。肝組織標(biāo)本行蘇木精--伊紅染色、纖維Masson染色等染色，進(jìn)行Knodell壞死炎癥評分和Ishak纖維化評分。Logistic回歸分析相關(guān)危險因素，受試者工作曲線下面積（the area of receiver operating

7、characteristic(ROC) curve,AUC）評價相應(yīng)因素的診斷價值。
　　結(jié)果: HBeAg陽性 PNALT,PIALT1和 PIALT2中度以上炎癥壞死比率分別為16.23%（37/228）,26.74%(50/187)和30.13%（47/156）;中度以上肝纖維化比率分別為14.47%（33/228）,22.46%(42/187)和23.72%（37/156）; HBeAg陰性PNALT,PIALT1和PIA

8、LT2中度以上炎癥壞死比率分別為13.30%（48/361）,22.11%(44/199)和24.60%（31/126）;中度以上肝纖維化比率分別為16.62%（60/361）,23.62%(47/199)和25.40%（32/126）。將ALT正常與否視為二分類變量，Logistic回歸分析HBeAg陽性慢性乙肝感染者發(fā)現(xiàn)HBV DNA高載量，AST以及年齡40~60歲是ALT異常的獨(dú)立危險因素；Logistic回歸分析HBeAg陰性

9、慢性乙肝感染者發(fā)現(xiàn)AST以及年齡40~60歲是ALT異常的獨(dú)立危險因素。將顯著性炎癥壞死和顯著性肝纖維化分別與非顯著性病理損傷視為二分類變量，Logistic回歸分析HBeAg陽性PNALT發(fā)現(xiàn)無相關(guān)獨(dú)立危險因素與顯著性肝病理損傷有關(guān)；同樣方法發(fā)現(xiàn)HBeAg陰性PNALT發(fā)現(xiàn)年齡40~60歲是顯著性肝纖維化的獨(dú)立危險因素。使用ROC觀察AUC發(fā)現(xiàn)ALT在對PIALT與PNALT的診斷價值上，對顯著性炎癥壞死有一定的診斷價值而無論E抗原狀

10、態(tài)，但只對E抗原陰性慢性乙肝肝纖維化有一定診斷價值。但如單一針對PNALT患者在肝組織病理損傷上無診斷價值。
　　結(jié)論:大樣本連續(xù)性觀察了PNALT和 PIALT慢性乙肝感染者的臨床和肝組織病理學(xué)特點，發(fā)現(xiàn)ALT在對PIALT與PNALT的診斷價值上仍一定程度反映了肝組織學(xué)的損傷程度，但對PNALT人群無肝組織學(xué)的損傷診斷價值。
　　第二部分無創(chuàng)肝纖維化診斷技術(shù)在PNALT慢性乙肝感染者中的應(yīng)用
　　目的:ALT難以區(qū)

11、別PNALT慢性乙肝感染者，了解無創(chuàng)肝纖維化診斷技術(shù)在PNALT慢性乙肝感染者中的診斷效應(yīng)
　　方法:研究采用回顧前瞻性研究，病例來自于我院2013年8月至2014年10月所有的慢性乙肝感染者進(jìn)行肝穿刺病理檢查并進(jìn)行過 FibroScan檢測的患者，病例包含第一部分中部分和新入組病人，共入選245例，PNALT共95例，其中HBeAg陽性45例，HBeAg陰性，50例；PIALT(ALT1-2ULN,n=86)，其中HBeAg陽性

12、36例，HBeAg陰性，50例；PIALT(ALT≥2ULN,n=64)，其中HBeAg陽性26例，HBeAg陰性，38例。使用APRI（aspartate aminotransferase to platelet ratio index），F(xiàn)IB-4(fibrosis-4)以及瞬間肝臟彈性測定（transient elastography）對上述病人進(jìn)行測定，使用受試者工作曲線下面積（AUC）評價這三種無創(chuàng)肝纖維化指標(biāo)或技術(shù)的診斷效應(yīng)

13、。
　　結(jié)果:APRI的檢測值在PNALT,PIALT1，PIALT2分別為0.32±0.14，0.61±0.44，1.25±0.62（F=284.92,P<0.001）;FIB-4在各組分別為0.72±0.36，1.12±0.53，1.67±0.84，（F=56.37，P<0.001） FibroScan檢測值LSM(KPa)為5.33±2.45，7.36±3.14，10.22±5.53（F=46.34,P<0.001）。PNA

14、LT,PIALT1和PIALT2中度以上炎癥壞死比率分別為16.81%（16/95）,32.56%(28/86)和45.31%（28/64）;中度以上肝纖維化比率分別為23.96%（23/95）,33.72%(29/86)和43.75%（28/64）;PIALT組炎癥壞死還是肝纖維化程度均較PNALT組嚴(yán)重（P均<0.05）。APRI對PNALT，PNALT1，PNALT2和所有病人的AUC分別為0.518（截斷值0.202，P=0.7

15、852）；0.659（截斷值0.524，P=0.011）；0.735（截斷值1.26，P<0.001）;0.65（截斷值1.15，P<0.001）。FIB-4對PNALT，PNALT1，PNALT2和所有病人的AUC分別為0.597（截斷值0.698，P=0.152）；0.642（截斷值1.174，P=0.021）；0.667（截斷值1.46，P=0.015）;0.659（截斷值0.96，P<0.001）。Fibroscan對PNALT

16、，PNALT1，PNALT2和所有病人的AUC分別為0.769（截斷值7.3，P<0.001）；0.8（截斷值7.5，P<0.001）；0.708（截斷值8.5，P=0.017）;0.763（截斷值7.5，P<0.001）。三種無創(chuàng)性肝纖維化指標(biāo)的診斷價值比較發(fā)現(xiàn)，在PNALT組LSM比較APRI和 FIB-4曲線下面積差均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05）；在PIALT1組，無論APRI比較FIB-4，還是LSM比較APRI和 FIB-4

17、曲線下面積差均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05）；同樣地，在PIALT2組，無論APRI比較FIB-4，還是LSM比較APRI和 FIB-4曲線下面積差也均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05）；對總體病人的比較，可以看到，僅有LSM比較APRI曲線下面積差有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），APRI比較FIB-4或者LSM比較FIB-4均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05）。
　　結(jié)論:常用的血清學(xué)肝纖維化診斷指標(biāo)APRI和 FIB-4，對PNALT慢

18、性乙肝感染者不是理想的診斷模型，APRI和FIB-4根據(jù)常用的血液生化指標(biāo)建立，更適合ALT異常的慢性乙肝。而Fibroscan是通過測定肝臟硬度來判斷肝纖維化程度，由于受肝臟炎癥壞死的影響較大，雖然對無論 ALT增高與否均有較好的診斷效應(yīng)，但對ALT正常慢性乙肝其診斷效應(yīng)更高。
　　第三部分深度測序分析顯著肝組織損傷的PNALT慢性乙肝感染者的差異microRNA血清表達(dá)
　　目的:使用新一代深度測序檢測顯著肝組織學(xué)損傷的

19、PNALT慢性乙肝感染者的血清miRNA的差異表達(dá)
　　方法:使用Illumina Hisque2000對6例顯著肝組織學(xué)損傷（中度以上的炎癥壞死或者中度以上的肝纖維化）的PNALT慢性乙肝（SPNALT）,6例無顯著肝組織學(xué)損傷（輕度及以下的炎癥壞死或者輕度及以下的肝纖維化）的PNALT慢性乙肝（NSPNALT）和6例正常健康人（healthy control），操作步驟按照公司提供的流程進(jìn)行，所有Illumina Hisque

20、2000測序數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為Log2，三組樣品間的兩兩比較使用卡方（chi-square）和精確概率法（fisher exact test）處理。篩選條件是倍數(shù)差異2倍以上和P<0.01。
　　結(jié)果:三組混合樣本（健康對照，NSPNALT和SPNALT）的Illumina Hisque2000測序的小RNA共分別產(chǎn)生7,896,608,8,580,434和7,485,507個 raw-reads,經(jīng)過進(jìn)一步處理和質(zhì)量控制，raw-rea

21、ds減少到494,523,659,447和441,182 clean reads。miRNA長度集中分布在20~24nt，總共有2767個獨(dú)一的reads和人類miRNAs或者pre-miRNAs吻合。從SPNALT與健康對照比較，可以看出有143個miRNA有顯著性差異表達(dá)，其中有22個miRNAs4倍上調(diào)，且P<0.01，有4個miRNAs4倍下調(diào)，且P<0.01；從SPNALT與NSPNALT比較，可以看出有88個miRNA有顯著

22、性差異表達(dá)，其中有13個miRNAs4倍上調(diào)，且P<0.01，有21個miRNAs4倍下調(diào)，且P<0.01。
　　結(jié)論: Illumina Hisque2000測序，發(fā)現(xiàn)了SPNALT與NSPNALT和健康對照組之間存在血清miRNA的差異表達(dá)，結(jié)果已經(jīng)被GEO(Gene Expression Omnibus)收錄，收錄號為G62290.
　　第四部分血清miRNA在SPNALT慢性乙肝感染者的診斷價值
　　目的:mi

23、RNA具有良好的生物標(biāo)記物特性，它們定義明確、化學(xué)結(jié)構(gòu)一致、便于物種化管理以及在細(xì)胞和循環(huán)中均穩(wěn)定表達(dá)。通過篩選驗證發(fā)現(xiàn)血清miRNA在SPNALT慢性乙肝感染者的診斷價值。
　　方法:創(chuàng)造性地運(yùn)用“四步篩選法”篩選上部分在發(fā)現(xiàn)階段采用新一代深度測序技術(shù)（Illumina Hiseq2000）發(fā)現(xiàn)的差異血清miRNA，再通過篩選階段，使用qRT-PCR的方法，選定內(nèi)參miRNA，建立均一的少量隊列篩選集（健康對照20例，NSPNA

24、LT20例，SPNALT20例），篩選出miRNA Ct value<35和detection rate>75%;p<0.05的miRNA。篩選出候選miRNA后，進(jìn)入訓(xùn)練階段（健康對照62例，NSPNALT72例，SPNALT65例），使用qRT-PCR對大樣本訓(xùn)練集檢驗?zāi)康膍iRNA，并使用LogiticP建立miRNA模型。最后是驗證階段（健康對照40例，NSPNALT55例，SPNALT53例），利用訓(xùn)練集建立的miRNA模型，

25、對獨(dú)立建立的隊列驗證集進(jìn)行驗證，評價其診斷價值。
　　結(jié)果: SPNALT vs總對照訓(xùn)練出候選miRNA7個，分別是hsa-miR-885-5p，hsa-miR-10a-5p，hsa-miR-511-5p，hsa-miR-574-5p，hsa-miR-98-5p，hsa-miR-26a-5p，hsa-miR-30b-5p; SPNALT vs Healthy訓(xùn)練出候選miRNA6個，分別是hsa-miR-885-5p，hsa-m

26、iR-122-5p，hsa-miR-574-5p，hsa-miR-26a-5p，hsa-miR-192-5p hsa-miR-30b-5p; SPNALT vs NSPNALT訓(xùn)練出候選miRNA5個, hsa-miR-122-5p, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-511-5p, hsa-miR-98-5p, hsa-miR-30b-5p。SPNALT區(qū)別健康對照組的LogisticP1=-4.0262-0.28851

27、XmiR_122-0.50803X miR_885+0.85701X miR_26a；SPNALT區(qū)別 NSPNALT組的LogisticP2=-43.5606+0.84629X miR_122+0.67945X miR_30b-0.29171X miR_511+0.56001X miR_98； SPNALT區(qū)別總對照組的LogisticP3=-15.5745-0.38122X miR_10a+0.27707X miR_30b-0.33

28、520X miR_885+0.88670X miR_98。SPNALT區(qū)別總對照組miRNA panel3的診斷價值:AUC=0.826(95%CI=0.775–0.878，sensitivity=70.8%, specificity=83.4%, p<0.01)；SPNALT區(qū)別健康組miRNA panel1的診斷價值:AUC=0.836;95%CI,0.775~0.897，sensitivity78.7%,specificity83

29、.3%, p<0.01);SPNALT區(qū)別NSPNALT組miRNA panel2的診斷價值:AUC=0.864，95%CI,0.813~0.916，sensitivity79.6%, specificity84.7%，p<0.01)。
　　結(jié)論:我們利用四步篩選法發(fā)現(xiàn)了可以區(qū)別于健康對照和無顯著肝組織損傷的PNALT的血清miRNA panels.
　　創(chuàng)新點：
　　1、大樣本、連續(xù)回顧前瞻性的研究了PNALT慢性乙