乙肝病毒X基因變異對(duì)AR在乙肝致癌過(guò)程中作用的影響.pdf

1、研究目的：
　　構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人AR的HepG2細(xì)胞系，分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒、HBx野生型質(zhì)粒和變異型質(zhì)粒至HepG2細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的遷移力、增殖周期和細(xì)胞凋亡等，探究HCC相關(guān)HBx變異與AR的交互作用對(duì)肝癌惡性程度的影響。
　　研究方法：
　　1.構(gòu)建攜帶人AR外顯子基因、綠色熒光蛋白基因(GFP)及嘌呤霉素基因(PM)的重組表達(dá)質(zhì)粒(pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro);2.重組表達(dá)質(zhì)粒包裝感染Hep

2、G2細(xì)胞及嘌呤霉素加壓篩選，構(gòu)建能穩(wěn)定表達(dá)人AR的HepG2細(xì)胞系;3.分別以慢病毒空載體、攜帶HBx野生型全長(zhǎng)基因的慢病毒載體以及攜帶A1727G+A1762T/G1764組合突變或3'端缺失突變的HBx基因的慢病毒載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2-GFP-AR細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，觀察不同HBx與AR在乙肝相關(guān)性肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建了攜帶人AR基因的慢病毒表達(dá)

3、載體pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro-AR。2.通過(guò)攜帶AR基因的慢病毒感染HepG2細(xì)胞，篩選出穩(wěn)定高表達(dá)人AR的HepG2細(xì)胞株，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證其GFP的表達(dá)量，傳至第10代后，該細(xì)胞株GFP的表達(dá)量為97.7％; Western-blot實(shí)驗(yàn)鑒定單克隆細(xì)胞株傳至第14代時(shí)AR的表達(dá)量，2號(hào)克隆AR的表達(dá)量較高。3.選取AR表達(dá)量較高的2號(hào)克隆用于后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:HBx空轉(zhuǎn)染組在加入

4、DHT后，下室中細(xì)胞OD值（0.45±0.02）顯著高于未加DHT組(0.33±0.03)，p＜0.001;與未轉(zhuǎn)染HBx基因的HepG2-GFP-AR細(xì)胞（空-組）(0.33±0.03)比較，轉(zhuǎn)染攜帶HBxA1727G+A1762T/G1764組合突變(167-組)(0.43±0.01，p=0.001)或3'端缺失突變(CT-組)(0.45±0.03，p＜0.001)的質(zhì)粒后，下室中細(xì)胞OD值顯著增高;HepG2-GFP-AR細(xì)胞在分

5、別轉(zhuǎn)染HBx A1727G+A1762T/G1764組合突變（167-組）或3'端缺失突變（CT-組）的質(zhì)粒后，加入DHT時(shí)，下室中細(xì)胞OD值顯著降低（167-組 vs167+組，0.43±0.01 vs0.36±0.02，p=0.009; CT-組vs CT+組，0.45±0.03 vs0.35±0.04，p=0.001)。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:各組間G2+S期細(xì)胞總占比無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:各組間細(xì)胞總凋亡率無(wú)顯著

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　1.本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了攜帶人AR外顯子基因的慢病毒表達(dá)載體pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro-AR;并利用該載體，慢病毒感染HepG2細(xì)胞，成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)AR的HepG2細(xì)胞系HepG2-GFP-AR。
　　2.通過(guò)AR高表達(dá)細(xì)胞系HepG2-GFP-AR進(jìn)一步功能實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在高表達(dá)AR的HepG2-GFP-AR細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染空載體組加入DHT后細(xì)胞遷移能力顯著增強(qiáng)，而轉(zhuǎn)染