TCDD對大鼠睪丸間質(zhì)細胞凋亡的影響及其機制.pdf

1、目的：
　　探討不同濃度2,3,7,8-四氯二苯并二噁英（2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）對雄性 SD大鼠睪丸間質(zhì)細胞（Leydig cell）凋亡的影響及其作用機制。從而探討TCDD生殖毒性的可能機制，為預(yù)防相關(guān)性疾病提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　取8-10周齡的性成熟期SPF級雄性SD大鼠，在屏障環(huán)境下飼養(yǎng)2周后，進行了睪丸間質(zhì)細胞分離培養(yǎng)以及細胞鑒定。通過建立的

2、睪丸間質(zhì)細胞體外培養(yǎng)模型，利用生長狀態(tài)較好的第三代 leydig細胞進行體外實驗。根據(jù) TCDD作用濃度，本實驗共分為5組：0 nM組（即對照組）、1 nM組、5 nM組、10 nM組以及50 nM組。采用噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法觀察不同濃度TCDD組別處理大鼠睪丸間質(zhì)細胞24h對細胞增殖的影響；利用熒光探針DCFH-DA對細胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species,

3、ROS）水平進行檢測；Annexin V-FITC/PI染色法聯(lián)合激光共聚焦顯微鏡觀察細胞凋亡情況；采用Western blot法檢測細胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax, Bcl-2, Caspase-3表達水平的變化。運用RT-PCR法檢測細胞中凋亡相關(guān)基因Bax, Bcl-2,Caspase-3 mRNA表達的變化。
　　結(jié)果：
　　通過3β-羥基類固醇脫氫酶（3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-

4、HSD）結(jié)果顯示，細胞均被染成藍黑色，說明該方法分離leydig細胞純度較高。MTT結(jié)果顯示，隨著TCDD的濃度增加，leydig細胞吸光度值呈逐漸下降趨勢(P<0.05)，并呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。ROS結(jié)果顯示，隨著濃度的增加，細胞內(nèi)ROS水平呈上升趨勢(P<0.05)。顯微鏡下觀察，隨著染毒劑量的增加，細胞凋亡陽性信號比率也逐漸上升。蛋白印記（Western blot）結(jié)果顯示，與對照組相比，5、10、50 nM染毒組大鼠睪丸間質(zhì)細

5、胞Bax、Caspase-3蛋白相對表達量明顯增加，而Bcl-2蛋白水平隨TCDD濃度增加呈降低趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果與Western blot結(jié)果一致，隨著濃度的增加Bax、Caspase-3 mRNA水平呈逐漸上升趨勢，而Bcl-2水平隨TCDD濃度的增加呈下降趨勢，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　TCDD能抑制大鼠睪丸間質(zhì)細胞的增殖而誘導(dǎo)其凋亡，并增加細胞內(nèi)R