NF-κB-AKT通路影響前列腺癌進展的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面展開論述：
　　第一部分 NF-κB通路影響前列腺癌進展的研究
　　背景：前列腺癌(prostate cancer， PCa)是發(fā)生于前列腺上皮的惡性腫瘤，在老年男性中最常見。世界范圍內(nèi)，前列腺癌發(fā)病率位于男性所有惡性腫瘤的第二位，死亡率居第六位。我國前列腺癌發(fā)病率相對較低，但近年來其發(fā)病率逐漸增高。多項研究提示慢性炎癥在包括前列腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演重要作用。巨噬細胞(Macroph

2、age)是腫瘤微環(huán)境中重要的炎癥細胞，可通過多種途徑調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞和腫瘤細胞間的直接交流可導(dǎo)致腫瘤細胞向外擴散并進入血液系統(tǒng)，因此巨噬細胞被認(rèn)為是腫瘤微環(huán)境中的關(guān)鍵因素。
　　核轉(zhuǎn)綠因子(Nuclear factor-kappaB，NF-κB)被認(rèn)為是炎癥和免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因素。研究證實NF-κB在多種惡性腫瘤中處于異常激活狀態(tài)，而抑制NF-κB的活性可抑制多種腫瘤的進展，提示NF-κB在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)

3、揮重要作用。此外，有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB是腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）中重要的整合腫瘤微環(huán)境信號的調(diào)節(jié)分子。通過特殊方法去除TAM中NF-κB的作用，可顯著抑制腫瘤的發(fā)展，表明NF-κB是腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)腫瘤進展的重要信號通路，可作為治療惡性腫瘤的一個潛在靶點。
　　目的：本研究分別以三種常見的前列腺癌細胞株（LNCaP, DU145，PC-3）和巨噬細胞為模型，構(gòu)建共培養(yǎng)體系，觀察巨噬細胞對前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響;評估s

4、msDX對巨噬細胞刺激的前列腺癌細胞增殖、侵襲能力的抑制作用。明確NF-κB在前列腺癌發(fā)展過程中的作用，并探討smsDX對前列腺癌中NF-κB可能的調(diào)節(jié)作用。為研究激活腫瘤微環(huán)境somatostatin-NF-κB途徑抑制晚期前列腺癌發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：PMA刺激THP-1細胞獲得巨噬細胞，將巨噬細胞上清液單獨或加入smsDX，分別與LNCaP, DU145，PC-3細胞混合培養(yǎng)。用細胞活力試驗(CCK-8 assays

5、)和克隆形成實驗(Clony formation assay)檢測前列腺癌細胞增殖的變化。通過細胞劃痕(Scratch migration assay)和Transwell遷移侵襲試驗(Transwell migration andinvasion assay)評估前列腺癌細胞遷移侵襲能力的變化。用裸鼠荷瘤實驗觀察smsDX和巨噬細胞對前列腺癌細胞體內(nèi)增殖的影響，并檢測裸鼠皮下腫瘤中CD68和NF-κB蛋白的表達情況。通過免疫組化技術(shù)(

6、Immunohistochemistry)分別檢測前列腺增生，慢性前列腺炎和前列腺癌組織標(biāo)本中CD68和NF-κB蛋白的表達情況，評估巨噬細胞浸潤數(shù)量與NF-κB表達的關(guān)系。運用免疫印跡技術(shù)(Western blot)和免疫熒光(Immunofluorescence)評估NF-κB的蛋白表達和核轉(zhuǎn)位情況。
　　結(jié)果：通過CCK-8和克隆形成實驗檢測細胞活力變化，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞可顯著促進前列腺癌細胞體外的增殖和克隆形成，而smsDX可

7、減弱巨噬細胞刺激的前列腺癌細胞增殖和克隆形成的變化。細胞劃痕和Traswell實驗表明巨噬細胞增強了前列腺癌細胞體外的遷移侵襲能力，而smsDX可抑制這種作用。進一步通過裸鼠荷瘤實驗發(fā)現(xiàn)巨噬細胞同樣能促進前列腺癌細胞裸鼠皮下的增殖，而smsDX可以明顯抑制裸鼠皮下的腫瘤體積。檢測不同前列腺疾病組織標(biāo)本中巨噬細胞的浸潤與NF-κB的表達，發(fā)現(xiàn)前列腺癌和慢性前列腺炎組織標(biāo)本中存在較多巨噬細胞浸潤，巨噬細胞的浸潤數(shù)量與NF-κB的激活有一定相

8、關(guān)性。進一步檢測巨噬細胞和smsDX分別作用后前列腺癌細胞中NF-κB的表達，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞可上調(diào)NF-κB在前列腺癌細胞核中的表達，同時伴隨胞漿中NF-κB下調(diào);smsDX作用則抑制了NF-κB在細胞核和胞漿中的變化。免疫熒光實驗進一步證實smsDX可以抑制巨噬細胞誘導(dǎo)的前列腺癌細胞中NF-κB的核轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)論：巨噬細胞能夠激活NF-κB促進前列腺癌細胞的增殖，遷移和侵襲，smsDX通過NF-κB途徑抑制腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞對

9、前列腺癌的刺激作用。研究為smsDX作為聯(lián)合治療前列腺癌中的輔助用藥提供了理論基礎(chǔ)。
　　研究創(chuàng)新：
　　通過本課題研究，加深了腫瘤微環(huán)境中TAM對前列腺癌進展影響的認(rèn)識，進一步驗證了NF-κB在前列腺癌進展過程中的重要作用。抑制NF-κB途徑可減弱巨噬細胞對前列腺癌的刺激作用，為治療前列腺癌提供了新的思路。
　　第二部分 AKT-mTOR通路對前列腺癌進展的影響
　　背景：前列腺癌是老年男性常見的惡性腫瘤，發(fā)病

10、率居我國男性腫瘤第七位。在臨床上，早期前列腺癌為雄激素依賴性腫瘤，對內(nèi)分泌治療有良好的反應(yīng)，但許多患者在接受內(nèi)分泌治療后1-3年內(nèi)，逐步進展為雄激素非依賴性前列腺癌(Androgen-independent prostate cancer, AIPC)。此時患者多發(fā)生骨骼等遠處轉(zhuǎn)移，對雄激素去勢治療敏感性下降，目前無其它有效治療措施，5年生存率僅為29％。研究發(fā)現(xiàn)約70％晚期前列腺癌患者存在骨轉(zhuǎn)移灶，而骨骼等遠處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致前列腺癌預(yù)后不

11、良的重要原因。
　　PI3K-AKT-mTOR通路調(diào)控多種腫瘤細胞的增殖，凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。有研究發(fā)現(xiàn)該通路在原發(fā)性前列腺癌中有42％表達上調(diào)，而在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中則高達100％。抑制該通路可有效抑制前列腺癌的增殖轉(zhuǎn)移。這表明PI3K-AKT-mTOR在前列腺癌發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，抑制該通路可作為治療前列腺癌的一個潛在靶目標(biāo)。
　　中藥黃芩是從唇形科植物黃芩的干燥根中提取的一種成分?，F(xiàn)在藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芩具有抗

12、炎、抗病毒、抗氧化、抗過敏、抗腫瘤的功能。黃芩素(Baicalein)是黃芩的一種活性成分，大量研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素能夠抑制肝細胞癌、骨肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌和直腸癌細胞的增殖、侵襲，誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡。上述研究表明黃芩素具有廣泛的抗腫瘤活性。但目前黃芩素對雄激素非依賴性前列腺癌細胞生物學(xué)的影響未見報道。黃芩素能否通過PI3K-AKT-mTOR通路抑制雄激素非依賴性前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡尚未明確。因此在本課題第

13、二部分，深入研究了黃芩素對雄激素非依賴性前列腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移和凋亡的影響，并探討PI3K-AKT-mTOR通路的重要作用。
　　目的：本研究以雄激素非依賴性前列腺癌細胞株DU145和PC-3細胞為模型，觀察了黃芩素對DU145和PC-3細胞活力、凋亡、遷移和侵襲的影響。評估了黃芩素處理后，DU145和PC-3細胞中凋亡相關(guān)蛋白的變化，并檢測了黃芩素對前列腺癌細胞中caveolin-1，AKT和mTOR表達的影響。結(jié)果闡明了前列腺癌

14、細胞中caveolin-1/AKT/mTOR信號途徑在黃芩素調(diào)節(jié)的前列腺癌生物學(xué)行為中的作用。
　　方法：運用細胞活力檢測實驗評估不同濃度黃芩素作用不同時間對DU145和PC-3細胞增殖的影響，確定黃芩素最佳作用濃度和時間。將DU145和PC-3分別與20和40μM黃芩素作用48小時，用流式細胞凋亡檢測實驗(Flow cytometricapoptosis assays)評估黃芩素對雄激素非依賴性前列腺癌細胞凋亡的誘導(dǎo)作用。分別運

15、用劃痕實驗和Transwell遷移侵襲實驗檢測不同濃度黃芩素對雄激素非依賴性前列腺癌細胞遷移和侵襲的影響。
　　結(jié)果：體外實驗表明，黃芩素能夠顯著抑制DU145和PC-3細胞的增殖，并且抑制作用具有濃度和時間依賴性。細胞劃痕試驗結(jié)果表明，黃芩素可以抑制前列腺癌細胞的橫向遷移，且具有濃度依賴性。Transwell試驗進一步驗證了黃芩素對前列腺癌細胞遷移的抑制，并且表明黃芩素能夠顯著抑制前列腺癌細胞的侵襲，其抑制作用同樣具有濃度依賴性

16、。通過流式細胞技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)黃芩素可以誘導(dǎo)DU145和PC-3細胞的凋亡，并且具有濃度依賴性。20和40μM黃芩素使DU145和PC-3細胞凋亡數(shù)分別增加了0.83、1.82倍和0.24、1.13倍。表明與PC-3細胞相比，DU145對黃芩素誘導(dǎo)的細胞凋亡更加敏感。檢測黃芩素處理后前列腺癌細胞中凋亡相關(guān)蛋白表達發(fā)現(xiàn)，黃芩素可以上調(diào)Bax、PARP蛋白表達，而下調(diào)Bcl-2、survivin。進一步探討黃芩素調(diào)節(jié)前列腺癌生物學(xué)行為的分子機制

17、，發(fā)現(xiàn)黃芩素可下調(diào)兩株細胞中caveolin-1、p-AKT和p-mTOR的表達，而總AKT和總mTOR表達不受影響。給予PI3K抑制劑LY294002，可以增強黃芩素促進的Bax上調(diào)，而使Bcl-2下調(diào)更加明顯;而CCK-8和Transwell試驗表明LY294002可以降低DU145和PC-3細胞的活力和侵襲能力，并能夠增強黃芩素對DU145和PC-3細胞增殖和侵襲的抑制作用。
　　結(jié)論：黃芩素通過caveolin-1/AKT