小鼠三種胚胎干細胞系表觀相關基因的分析.pdf

1、細胞核的重編程可以通過將體細胞的細胞核移入卵母細胞，將體細胞和胚胎干細胞進行融合，以及向體細胞中轉入幾個轉錄因子例如Oct4，Sox2，C-myc，Klf4和 Nanog的方法實現(xiàn)，然而細胞核的重編程需要經(jīng)歷復雜的過程，其中最為重要的就是細胞核所發(fā)生的表觀遺傳學變化，本文主要綜訴了細胞核重編程的研究概況，產(chǎn)生干細胞的四種不同的方法和現(xiàn)代表觀遺傳學中干細胞的表觀遺傳學特性以及體細胞的表觀遺傳學變化。
　　 我們從培養(yǎng)ES細胞著手，

2、通過一年的摸索初步建立了小鼠胚胎成纖維細胞的體外培養(yǎng)平臺，并在此基礎上利用小鼠胚胎成纖維細胞經(jīng)過絲裂霉素c處理的方法建立了合格的胚胎細胞滋養(yǎng)層。同時綜合國內(nèi)外文獻，采用對小鼠注射激素，超數(shù)排卵，沖取3.5天的受精卵，接種于小鼠胚胎成纖維細胞制作的滋養(yǎng)層細胞上，在體外培養(yǎng)下使受精卵正常發(fā)育，并孵化，進而使受精卵在體外貼壁，等內(nèi)細胞團長大時用機械的方法挑取內(nèi)細胞團，從而建立了三株小鼠的胚胎干細胞系，經(jīng)過分子水平的鑒定，基本確定細胞系的成功。

3、
　　 基于胚胎細胞完整的培養(yǎng)體系，我們成功培養(yǎng)了ES細胞系，核移植胚胎干細胞系，IPS細胞系各兩株，在實驗室培養(yǎng)擴大后分別提取了各個細胞系的總RNA。在此基礎上設計定量引物，分別分析了與胚胎細胞表觀相關的表觀遺傳學基因，主要包括與DNA甲基化相關的基因Dnmt1、Dnmt3b、Dnmt3L、Aicda、與H3K27me3相關的基因Ezh2 Kdm6b Kdm6a，與H3K4me相關的基因 mllI LSDI與Histone A

4、c相關的基因Kat2a，以一株細胞ES細胞系作為對照，利用2-△△Ct法分析了這些基因在六株細胞系中的變化，結果顯示，在6個細胞系中ntES2 在各個基因中都比同類以及其他細胞系表達量要高，特別是在Dnmt1基因中要比同類細胞高出5倍多，由于此細胞在體外傳代次數(shù)較長已達到25代，因此有可能在體外傳代過程中引起細胞表觀修飾的改變，此現(xiàn)象已在文獻中有報道，對于此細胞系進一步的鑒定還需要進行。
　　 與H3K27me3相關的基因Ezh

5、2、Kdm6b、Kdm6a、與H3K4me相關的基因 mllI LSDI與Histone Ac相關的基因Kat2a 在六個細胞系中的表達量均未表現(xiàn)出變化。
　　 與DNA甲基化相關的基因中，Dnmt1基因在各個細胞系中的表達沒有表現(xiàn)出很明顯的變化，而Dnmt3b基因在兩株IPS細胞系中的表達量要比正常的ES細胞和核移植干細胞系低將近2倍。相反，Dnmt3L基因在兩株IPS細胞系中的表達量比正常的ES細胞和核移植ES細胞系高將近4