壓應(yīng)力作用下成骨細(xì)胞早期應(yīng)答中相關(guān)信號(hào)通路機(jī)制初探.pdf

1、目的:
　　力在骨改建過程中起著十分重要的作用，例如骨在長期負(fù)重情況下骨密度增加，而在失重環(huán)境中長期生活骨密度會(huì)發(fā)生一定程度的降低，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。在口腔正畸臨床治療過程中，對(duì)骨施加壓力使牙齒發(fā)生移位;種植治療中通過漸進(jìn)性負(fù)重促進(jìn)骨小梁的形成都是利用力對(duì)骨改建的重要作用。體外實(shí)驗(yàn)研究中，成骨細(xì)胞通過感知壓力作用，釋放出多種細(xì)胞因子以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞功能;而眾多細(xì)胞因子的改變主要是通過細(xì)胞內(nèi)部生物信號(hào)系統(tǒng)來調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。成骨細(xì)胞

2、受到機(jī)械應(yīng)力刺激后產(chǎn)生調(diào)控成骨與破骨的效應(yīng)，關(guān)聯(lián)相當(dāng)復(fù)雜的生物力學(xué)信號(hào)通路，其中促絲裂原激活蛋白激酶MAPK和AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞內(nèi)部傳遞生物信號(hào)的重要途徑，國內(nèi)外已有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)MAPK和AKT信號(hào)通路中相關(guān)蛋白能夠被機(jī)械刺激激活并調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能。細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路涉及的蛋白質(zhì)眾多，當(dāng)細(xì)胞受到壓應(yīng)力刺激時(shí)這些信號(hào)通路是如何調(diào)節(jié)骨改建功能，其中的反應(yīng)十分復(fù)雜。在不同加壓條件下哪些蛋白酶被壓應(yīng)力刺激激活發(fā)揮作用，對(duì)機(jī)械力產(chǎn)生早期應(yīng)答反應(yīng)

3、，從而導(dǎo)致不同的成骨或破骨效應(yīng)，目前尚無實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究證實(shí)。因此本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)三維培養(yǎng)的成骨細(xì)胞施加不同的壓應(yīng)力條件，采用磷酸化蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)相關(guān)蛋白因子磷酸化表達(dá)水平，以探討壓應(yīng)力作用下細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路激活情況。從而探究不同壓應(yīng)力作用下參與早期應(yīng)答反應(yīng)的相關(guān)信號(hào)通路，并篩選出壓應(yīng)力刺激早期應(yīng)答中參與調(diào)控成骨細(xì)胞功能的關(guān)鍵信號(hào)因子。
　　方法:
　　1.制作細(xì)胞培養(yǎng)和壓應(yīng)力加載裝置，利用本實(shí)驗(yàn)組自行制作的藻酸鈣凝膠培養(yǎng)孔作

4、為成骨細(xì)胞培養(yǎng)及加壓裝置;采用鼠尾Ⅰ型膠原作為成骨細(xì)胞的三維培養(yǎng)基質(zhì)。分別對(duì)成骨細(xì)胞施加2g/cm2、5g/cm2的壓應(yīng)力，持續(xù)加壓6h，以不加力組（稱為0g/cm2組）作為對(duì)照組。將加壓后的細(xì)胞膠原，經(jīng)羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽染色后共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞三維培養(yǎng)形態(tài)，采用CCK8法檢測(cè)3組細(xì)胞的活性。
　　2.對(duì)成骨細(xì)胞分別施加不同時(shí)間的壓力，實(shí)驗(yàn)組為2g/cm2、5g/cm2，對(duì)照組0g/cm2，分別持續(xù)加壓45min、3h和6h。

5、應(yīng)用磷酸化蛋白芯片技術(shù)，檢測(cè)不同壓應(yīng)力條件下MAPK以及AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)蛋白磷酸化的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.對(duì)成骨細(xì)胞施加2g/cm2、5g/cm2壓應(yīng)力作用6h后，通過羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1的肌動(dòng)蛋白染色，共聚焦熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞附著點(diǎn)成立體分布于細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)中;采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活性，結(jié)果顯示3組間的OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2.持續(xù)施力6h時(shí)2g/

6、cm2壓應(yīng)力CREB、AKT、HSP27、GSK3α、GSK3β、JNK、MSK2、p38、p53、p70s6k、ERK1/2磷酸化蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.05);5g/cm2壓應(yīng)力時(shí)CREB、MSK2、p38、p53、p70s6k、ERK1/2磷酸化蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);5g/cm2時(shí)AKT、GSK3β與HSP27的磷酸化蛋白表達(dá)量明顯低于2g/cm2組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。2g/cm

7、2組持續(xù)作用45min和3h時(shí)，各蛋白磷酸化表達(dá)水平與對(duì)照組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。壓應(yīng)力為5g/cm2時(shí)，持續(xù)作用45min，p70s6k磷酸化蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P=0.038＜0.05);RSK1在5g/cm2組磷酸化蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P=0.019＜0.05)。5g/cm2持續(xù)作用3h時(shí)HSP27、p70s6k和RSK2的磷酸化蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);其他磷

8、酸化蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的壓應(yīng)力加壓裝置及實(shí)驗(yàn)條件能夠維持成骨細(xì)胞三維培養(yǎng)形態(tài)，壓應(yīng)力加載條件不會(huì)影響成骨細(xì)胞活性。成功建立的壓應(yīng)力加載模型，可作為壓應(yīng)力相關(guān)研究的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
　　2.細(xì)胞持續(xù)加壓6h是相關(guān)信號(hào)通路對(duì)壓應(yīng)力產(chǎn)生早期應(yīng)答反應(yīng)的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)。
　　3.壓應(yīng)力作用下成骨細(xì)胞早期應(yīng)答反應(yīng)中相關(guān)信號(hào)通路的激活與壓應(yīng)力的大小有關(guān)。壓應(yīng)力分別持