Hippo信號(hào)通路在LPS誘導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞增殖的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　炎癥已經(jīng)被認(rèn)為是癌癥的第七種生物學(xué)特性。很多肺部慢性炎癥也能夠增加肺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，并在一定程度上促進(jìn)肺癌的進(jìn)展。脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）是革蘭氏陰性桿菌釋放的重要致炎因子，具有引起炎性免疫應(yīng)答及內(nèi)毒素休克等效應(yīng)。一些既往研究顯示，Hippo信號(hào)通路參與了肺癌細(xì)胞的增殖。本研究擬探究Hippo信號(hào)通路在LPS誘導(dǎo)的肺腺癌A549細(xì)胞增殖過(guò)程中的作用及其機(jī)制。
　　方法:
　　1

2、、培養(yǎng)A549細(xì)胞株，應(yīng)用CCK-8檢測(cè)LPS對(duì)A549增殖能力的影響;
　　2、應(yīng)用Western blot(WB)分別檢測(cè)不同濃度LPS處理A549后Hippo信號(hào)通路相關(guān)蛋白(Mst1、SAV1、LATS1、MOB1、P-MOB1、YAP和P-YAP(ser127))的表達(dá)變化;應(yīng)用WB分別檢測(cè)LPS處理不同時(shí)間點(diǎn)A549中Hippo信號(hào)通路相關(guān)蛋白(Mst1、YAP、P-YAP(ser127))的表達(dá)變化;應(yīng)用免疫熒光檢測(cè)

3、LPS處理后A549中YAP蛋白的定位變化;
　　3、A549轉(zhuǎn)染Cy3標(biāo)記的siRNA，應(yīng)用免疫熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率;應(yīng)用WB、逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)目的蛋白和mRNA的抑制率;
　　4、A549轉(zhuǎn)染Mst1 siRNA、YAP siRNA后，抑制Mst1、YAP表達(dá)，并應(yīng)用CCK-8檢測(cè)LPS對(duì)轉(zhuǎn)染Mst1

4、 siRNA、YAP siRNA后A549增殖能力的變化;
　　5、A549轉(zhuǎn)染Mst1 siRNA、YAP siRNA后，抑制Mst1、YAP表達(dá)，應(yīng)用WB檢測(cè)Mst1、YAP的表達(dá)變化;應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)YAP蛋白定位變化。
　　結(jié)果:
　　1、0.1μg/ml的LPS可顯著促進(jìn)A549細(xì)胞增殖;
　　2、LPS能夠下調(diào)A549細(xì)胞中Mst1、LATS1和p-mob1總蛋白的表達(dá)，上調(diào)SAV1、Mob1、Y

5、AP和p-YAP總蛋白的表達(dá)以及促進(jìn)YAP的核易位;LPS對(duì)肺癌A549細(xì)胞中YAP蛋白的定位無(wú)明顯影響;
　　3、Mst1 siRNA和YAP siRNA能夠成功轉(zhuǎn)染至肺癌A549細(xì)胞中，并且顯著抑制了A549細(xì)胞中Mst1和YAP的表達(dá);
　　4、轉(zhuǎn)染Mst1 siRNA后LPS對(duì)A549細(xì)胞的增殖作用無(wú)明顯變化，而轉(zhuǎn)染YAPsiRNA后LPS對(duì)A549細(xì)胞的促增殖作用明顯抑制;
　　5、轉(zhuǎn)染Mst1 siRNA后

6、，LPS能夠進(jìn)一步減少A549中Mst1的表達(dá)，并且顯著增加YAP的表達(dá);轉(zhuǎn)染YAP siRNA后，LPS對(duì)A549中Mst1的表達(dá)無(wú)明顯影響，而對(duì)YAP表達(dá)的促進(jìn)作用明顯減弱。
　　6、轉(zhuǎn)染Mst1 siRNA和YAP siRNA后，LPS對(duì)于A549細(xì)胞中YAP的表達(dá)定位無(wú)明顯影響。
　　結(jié)論:1、低濃度LPS能夠通過(guò)上調(diào)YAP表達(dá)促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖;2、YAP并不完全通過(guò)Hippo信號(hào)通路參與LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)