隱孔酸E抗甲型流感病毒活性及其作用機(jī)制初步探究.pdf

1、目的：
　　流感病毒感染至今仍是世界性公共衛(wèi)生難題，隨著耐藥毒株的不斷出現(xiàn)，抗流感病毒藥物的效果變得較為有限。因此，探尋新型藥物、尤其是在不同于現(xiàn)有藥物作用位點(diǎn)發(fā)揮作用的抗流感病毒藥物變得尤為重要。前期有研究結(jié)果表明，隱孔菌（Cryptoporus volvatus）提取物能在體外和體內(nèi)有效地抑制流感病毒的復(fù)制，但其中發(fā)揮主要作用的活性成分尚未證實(shí)。為闡明隱孔菌中具有抗流感病毒活性的有效成分，本課題對(duì)隱孔菌進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分分析

2、，并對(duì)隱孔菌90％乙醇提取物中八種較為主要的單體化合物進(jìn)行活性篩選。此外，初步探究了隱孔酸E抑制甲型流感病毒在MDCK細(xì)胞中復(fù)制的作用機(jī)制，為后續(xù)開發(fā)隱孔菌用于治療甲型流感病毒感染提供數(shù)據(jù)支持。
　　方法：
　　通過病毒滴度測(cè)定實(shí)驗(yàn)，計(jì)算隱孔菌中8種化合物抑制甲型流感病毒活性的IC50，篩選到具有較強(qiáng)抗流感病毒活性的化合物隱孔酸E(Cryptoporic acid E，CAE)進(jìn)行研究。通過MTT法測(cè)定化合物對(duì)于流感病毒宿主

3、細(xì)胞增殖活力的影響，選取抗流感病毒活性較好且不影響宿主細(xì)胞增殖活力的化合物濃度用于后續(xù)研究。通過測(cè)定在不同MOI時(shí)，隱孔酸E對(duì)流感病毒生長(zhǎng)曲線的影響，進(jìn)一步確認(rèn)隱孔酸E的抗流感病毒活性。通過間接免疫熒光染色和TCID50法測(cè)定病毒滴度，確定隱孔酸E對(duì)不同亞型的四種流感毒株復(fù)制的抑制作用。將CAE與宿主細(xì)胞或流感病毒共孵育后測(cè)定病毒滴度以及階段加藥實(shí)驗(yàn)，對(duì)CAE的作用位點(diǎn)和時(shí)期進(jìn)行初步確定。通過定量RT-PCR法檢測(cè)CAE對(duì)流感病毒3種R

4、NA合成的影響。通過微基因組實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CAE對(duì)流感病毒聚合酶活性的抑制作用，結(jié)合對(duì)vRNP核轉(zhuǎn)位情況的觀察結(jié)果，從而初步確定CAE抑制甲型流感病毒在MDCK細(xì)胞中復(fù)制的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　由抗流感病毒活性篩選實(shí)驗(yàn)和病毒生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果可知，隱孔酸E能劑量依賴、時(shí)間依賴地抑制流感病毒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制，MTT實(shí)驗(yàn)證明CAE對(duì)流感病毒宿主細(xì)胞毒性較小。間接免疫熒光染色結(jié)果和病毒滴度的測(cè)定結(jié)果表明，CAE的抗甲型流感病毒能

5、力并不局限于單一毒株：隱孔酸E對(duì)于H1N1和H3N2兩種亞型的4種流感毒株都具有較強(qiáng)的抗病毒活性。階段加藥實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明，CAE主要在甲型流感病毒生命周期的中期發(fā)揮抑制作用。定量RT-PCR的結(jié)果表明，CAE能劑量依賴地抑制流感病毒vRNA，cRNA和mRNA的合成。微基因組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)：CAE能夠顯著抑制病毒RNA聚合酶的活性，從而抑制流感病毒基因組在MDCK細(xì)胞中的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。此外，還發(fā)現(xiàn)CAE能直接靶向病毒顆粒，影響流感病毒的感