淫羊藿苷對cuprizone誘導的小鼠模型髓鞘再生的影響及機制研究.pdf

1、實驗目的:
　　多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種以中樞神經系統(central nervoussystem，CNS)炎性脫髓鞘病變?yōu)橹饕±砀淖兊淖陨砻庖咝约膊?，多以癥狀、體征的反復發(fā)作與緩解交替為特點。自MS開始發(fā)病時，軸突變性、神經元死亡等功能障礙和結構損傷的病理特征便已出現，并且在疾病的緩解期，該病理損傷也呈進行性與累積性。因此，在MS的緩解期間用藥能對髓鞘、軸突的再生起到重要促進作用。淫羊藿苷

2、(Icariin，ICA)是從傳統補腎中藥淫羊藿中提取出的有效單體成分，既往報道稱其具有神經保護功能、對抗氧化應激誘導的神經變性及提高記憶力的作用。為進一步探究ICA對髓鞘再生修復的作用及其機制，本實驗采用cuprizone(CPZ)誘導C57BL/6J小鼠制備髓鞘脫失的MS模型，從軸突完整性、成熟少突膠質細胞數量、神經再生等角度觀察，探究ICA促進髓鞘再生修復作用的可能機制，為MS治療藥物的開發(fā)提供新的實驗依據。
　　實驗方法:

3、
　　1、以摻入含有0.2％w/w cuprizone(CPZ)的常規(guī)嚙齒類動物飼料飼喂C57BL/6小鼠制備急性髓鞘脫失動物模型，飼喂5周，誘導其發(fā)生急性脫髓鞘和少突膠質細胞凋亡，隨后更換為不含CPZ的常規(guī)飼料飼喂小鼠1周誘發(fā)髓鞘自行修復。實驗分為6組:對照組、溶媒對照組、CPZ模型組、CPZ+ICA6.25、12.5、25 mg/kg/day組。再生修復期間，各劑量ICA組經口腔灌服相應劑量的受試藥物ICA，溶媒對照組灌服IC

4、A配制溶劑（0.5％羧甲基纖維素鈉溶液），對照組和CPZ模型組均灌服等體積蒸餾水。每周記錄各組小鼠體重變化。
　　2、分別于CPZ造模5周后及再生修復1周后取小鼠腦組織，采用堅牢藍(Luxolfast blue，LFB)染色法觀察腦內胼胝體區(qū)的髓鞘脫失的變化;采用免疫組織化學染色法觀察髓鞘脫失和再生的形態(tài)學變化;采用免疫熒光化學染色法檢測軸突的損傷和再生修復、成熟少突膠質細胞的新生以及神經生長因子NGF在神經元中的表達等生物學情況

5、。
　　實驗結果:
　　1、隨著飼喂CPZ飼料時間的延長，C57BL/6J小鼠出現體重減輕的現象，將CPZ飼料撤離后，小鼠體重又恢復到與飼喂常規(guī)飼料時小鼠體重無明顯差異的水平。但ICA對其體重變化的影響并不顯著。飼喂CPZ飼料能夠成功誘導C57BL/6J小鼠胼胝體區(qū)域出現廣泛的髓鞘脫失。在LFB染色下，對照組小鼠在胼胝體區(qū)域因為髓鞘完整未受破壞而顯藍色，CPZ模型組小鼠則無法正常著色為藍染。
　　2、CPZ能夠損傷C5

6、7BL/6J小鼠胼胝體、額葉皮層區(qū)域的髓鞘和軸突，ICA能明顯增強再生修復期間的髓鞘、軸突的生長修復作用。免疫組織化學染色結果顯示，CPZ誘導小鼠的胼胝體、額葉皮層區(qū)域出現MBP含量減低，髓鞘脫失嚴重的病理改變，這一病理改變在經過1周的髓鞘自我再生修復后并未有所好轉，ICA能夠明顯促進髓鞘再生修復期間髓鞘的生成、重構，且呈劑量依賴性。免疫熒光化學染色結果則顯示，在經過5周的CPZ飼料誘導后，NF200陽性的軸突在胼胝體、額葉皮層區(qū)域出現

7、明顯損傷而丟失，ICA可以逆轉其丟失，促進再生修復期間的軸突生長修復。
　　3、CPZ能夠誘導C57BL/6J小鼠額葉皮層區(qū)域成熟少突膠質細胞（髓鞘生成細胞）的凋亡，ICA能夠明顯促進再生修復期間成熟少突膠質細胞的新生。本實驗發(fā)現，以Olig2和APC共標的成熟少突膠質細胞在CPZ模型組的額葉皮層中大大減少，ICA能夠通過促進成熟少突膠質細胞的新生，從而促進髓鞘的再生修復。
　　4、CPZ誘導下的C57BL/6J小鼠額葉皮層