香雪蘭查爾酮合酶基因的克隆及其原核表達.pdf

1、香雪蘭(Fressia hybrida)屬鳶尾科香雪蘭屬多年生球根草本花卉植物，其花色艷麗、花香濃郁，是深受人們喜愛的切花之一。查爾酮合成酶(Chalcone synthase，CHS)是花色苷生物合成代謝途徑的第一個關(guān)鍵酶，與植物花色的形成密切相關(guān)。本實驗克隆了香雪蘭CHS基因的cDNA序列和DNA序列，為植物花色研究奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:
　　1.從紅花香雪蘭花瓣cDNA文庫中隨機挑取單克隆進行單向測序，得到165個序列，去

2、除低質(zhì)量和載體污染序列后共獲得137個有效序列，序列長度在370-730bp之間。序列拼接后生成85個單拷貝序列，將85個序列用NCBI的blastx程序和EBI的fastx程序與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比對后，有79個序列比對出同源蛋白，占序列的93％。在比對出的同源蛋白中，有4個蛋白與花色形成相關(guān)。其中一個蛋白為查爾酮合酶，相對應的cDNA片段為香雪蘭查爾酮合酶基因cDNA3端序列。其余6個序列未比對出同源性基因，推斷這6個序列為新的基因片

3、段，可能是香雪蘭中特異性表達的基因。
　　2.以紅花香雪蘭花瓣為實驗材料，通過香雪蘭花瓣cDNA文庫的EST分析及RACE技術(shù)克隆了香雪蘭CHS基因的cDNA序列，命名為FhCHS，Genbank登錄號為JF732897。序列分析表明該序列長為1240bp，開放閱讀框長1170bp，推測其編碼389個氨基酸。預測其編碼蛋白分子量為42.6kDa，等電點為5.74。FhCHS氨基酸序列的同源性和系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，F(xiàn)hCHS基因是植

4、物查爾酮合酶基因家族中的一個新成員。
　　3.以香雪蘭基因組DNA為模板，克隆了香雪蘭CHS基因DNA序列，該序列全長為1369bp，Genbank登錄號為JF732898。序列分析表明，該DNA序列包含一個內(nèi)含子和兩個外顯子，這是CHS基因的一個典型特征。內(nèi)含子長為129bp，位于第60位半胱氨酸密碼子的內(nèi)部，內(nèi)含子兩端的剪切位點符合GT-AG法則。
　　4.構(gòu)建了FhCHS的重組原核表達載體pET28a-FhCHS，大腸