藍(lán)莓營(yíng)養(yǎng)成分及其改善大鼠肝纖維化機(jī)制中組蛋白乙?；揎椀难芯?pdf

1、第一部分貴州麻江藍(lán)莓營(yíng)養(yǎng)成分的研究
　　目的：
　　1.探討2016年貴州麻江藍(lán)莓營(yíng)養(yǎng)成分，并比較與10年前同品種藍(lán)莓營(yíng)養(yǎng)成分的比較的情況。
　　方法:
　　以直接滴定法、索氏脂肪提取器測(cè)定法、分光光度法及酸堿滴定法分別對(duì)藍(lán)莓中的糖、脂肪、蛋白質(zhì)及酸進(jìn)行檢測(cè)；以反向色譜分離法、酸性滴定法、正向色譜分離法、反向色譜分離法分別對(duì)藍(lán)莓中維生素A、C、D、E的含量進(jìn)行檢測(cè)；改良的Marklund方法（改良的鄰苯三酚自氧化

2、法）檢測(cè)SOD含量；以溶劑浸提法提取后高效液相色譜法（HPLC-MS）對(duì)藍(lán)莓花青素進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果：
　　貴州省麻江縣2016年種植的圓藍(lán)品種的藍(lán)莓蛋白質(zhì)、總糖的含量以及糖酸比均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,而脂肪、總酸的含量無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與2007年比較，2016年貴州省麻江縣種植的圓藍(lán)品種的SOD，藍(lán)莓花青素、維生素C、維生素E的含量有顯著性增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0

3、5），而維生素A、維生素D的含量無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與2007年比較，2016年藍(lán)莓中所含的Na+、Ca2+均顯著性增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而K+及Mg2+的含量無(wú)差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　研究表明，貴州省麻江圓藍(lán)品種藍(lán)莓具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，種植10年后藍(lán)莓的三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成分含量有所降低，與當(dāng)年降雨量增多及果樹(shù)樹(shù)齡增大有關(guān)；麻江圓藍(lán)藍(lán)莓中的花青素、維生素C、

4、維生素E的含量較高，且明顯高于2007年栽種初產(chǎn)果實(shí)中相關(guān)指標(biāo)的含量，這與藍(lán)莓成熟后花青素富集及成熟藍(lán)莓鮮果中鈉、鈣離子水平增加對(duì)藍(lán)莓花青素穩(wěn)定性增加而發(fā)生的增色效應(yīng)有關(guān)。
　　第二部分藍(lán)莓對(duì)肝纖維化大鼠肝臟組蛋白乙?；揎椉凹?xì)胞外基質(zhì)的影響
　　目的：
　　探討藍(lán)莓對(duì)四氯化碳（CCl4）致大鼠肝纖維化后大鼠血清的肝功能、肝纖維化三項(xiàng)，肝組織中細(xì)胞外基質(zhì)及組蛋白乙?；揎?acH3K9、acH3K14、acH3K18位

5、點(diǎn)修飾水平的影響。
　　方法:
　　50只雄性SD大鼠，180±20g，隨機(jī)分為對(duì)照組（Control group）、模型組（Hepatic Fibrosis group）、藍(lán)莓治療組（Blueberry Treatment group）、藍(lán)莓預(yù)防組（Blueberry Prevention group）、自然恢復(fù)組（Natural Recovery group），每組10只。除正常組外，其余各組用40%CCl4花生油溶液0

6、.3 mL/100 g皮下注射，間隔三天注射一次以制備大鼠肝纖維化模型，正常組大鼠皮下注射等量花生油溶液，實(shí)驗(yàn)12周末處死正常組與肝纖維化組大鼠，實(shí)驗(yàn)16周末處死剩余組大鼠；取各組大鼠血清檢測(cè)其肝功能、肝纖維化三項(xiàng)指標(biāo)；取各組大鼠肝臟，測(cè)定肝臟指數(shù)；取左肝葉組織常規(guī)固定，HE染色、Masson染色觀察組織病理改變情況；蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot，WB）檢測(cè)并比較各組大鼠右肝葉組織α-SMA、TIMP-1、Ⅰ型膠原表達(dá)情況

7、和acH3K9、acH3K14、acH3K18修飾水平變化。
　　結(jié)果：
　　1.關(guān)于肝指數(shù)，與正常組比較，肝纖維化組大鼠肝臟指數(shù)增加（P<0.05），與肝纖維化組比較，經(jīng)藍(lán)莓汁灌胃后，藍(lán)莓治療組與藍(lán)莓預(yù)防組大鼠的肝指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與自然恢復(fù)組比，藍(lán)莓預(yù)防組肝指數(shù)降低，有顯著性差異（P<0.05），而藍(lán)莓治療組無(wú)明顯變化，無(wú)明顯差異（P>0.05）；與藍(lán)莓治療組比較，藍(lán)莓預(yù)防組肝指數(shù)降低，有顯著性

8、差異（P<0.05）。2.根據(jù)肝纖維化分級(jí)，病理學(xué)檢查提示注射 CCl4花生油溶液的肝纖維化組大鼠肝組織內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝臟纖維結(jié)締組織明顯增多，部分區(qū)域有假小葉形成，明顯高于正常組大鼠，Masson染色觀察提示 CCl4花生油溶液注射后，肝纖維化組大鼠肝臟中膠原等細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)明顯增加，說(shuō)明肝纖維化造模成功；與模型組比較，藍(lán)莓治療組及藍(lán)莓預(yù)防組大鼠肝臟纖維化分級(jí)顯著性降低，有顯著性差異（P<0.01）；與自然恢復(fù)組比較，藍(lán)莓預(yù)防組

9、大鼠肝臟纖維化分級(jí)顯著性降低，有顯著性差異（P<0.01），而藍(lán)莓治療組大鼠肝臟纖維化分級(jí)無(wú)明顯變化，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。與藍(lán)莓治療組比較，藍(lán)莓預(yù)防組肝臟纖維化分級(jí)有明顯變化，有顯著性差異（P<0.05）。3.關(guān)于肝功能：（1）與正常組比較，模型組AST顯著增高（P<0.01）；與模型組比較，藍(lán)莓治療組及藍(lán)莓預(yù)防組AST顯著降低（P<0.01）；與自然恢復(fù)組比較，藍(lán)莓預(yù)防組顯著降低（P<0.01），藍(lán)莓治療組降低（P<0.

10、05）；與藍(lán)莓治療組比較，藍(lán)莓預(yù)防組有降低（P<0.05）；（2）與正常組比較，模型組 ALT顯著增高（P<0.01）；與模型組比較，藍(lán)莓治療組及藍(lán)莓預(yù)防組ALT顯著下降（P<0.01）；與自然恢復(fù)組比較，藍(lán)莓預(yù)防組ALT顯著降低（P<0.01），藍(lán)莓治療組無(wú)顯著性差異（P>0.05）；與藍(lán)莓治療組比較，藍(lán)莓預(yù)防組ALT降低（P<0.05）。3.關(guān)于肝纖維化指標(biāo)，（1）與正常組比較，模型組HA顯著增高（P<0.01）；與模型組比較，藍(lán)莓

11、治療組及藍(lán)莓預(yù)防組HA顯著降低（P<0.01）；與自然恢復(fù)組比較，藍(lán)莓預(yù)防組顯著降低（P<0.01），藍(lán)莓治療組降低（P<0.05）；與藍(lán)莓治療組比較，藍(lán)莓預(yù)防組降低（P<0.05）；（2）與正常組比較，余各組大鼠LN顯著性增加（P<0.05）。（3）與正常組比較，模型組Ⅳ-C顯著增高（P<0.01）；與模型組比較，藍(lán)莓治療組及藍(lán)莓預(yù)防組Ⅳ-C顯著降低（P<0.01）；與自然恢復(fù)組比較，藍(lán)莓治療組及藍(lán)莓預(yù)防組顯著降低（P<0.05）；與

12、藍(lán)莓治療組比較，藍(lán)莓預(yù)防組降低（P<0.05）；4.與正常組比較，模型組肝組織中的α-SMA、?型膠原和TIMP-1蛋白表達(dá)均增加，有顯著性差異（P<0.01)；與模型組比較：藍(lán)莓治療組、藍(lán)莓預(yù)防組及自然恢復(fù)組肝組織中的α-SMA、?型膠原和TIMP-1表達(dá)降低，有顯著性差異（P<0.01)；與自然恢復(fù)組比較，藍(lán)莓治療組及藍(lán)莓預(yù)防組肝組織中的α-SMA、?型膠原和 TIMP-1表達(dá)降低，有顯著性差異（P<0.05)，以藍(lán)莓預(yù)防組降低較為

13、明顯。與藍(lán)莓治療組比較，藍(lán)莓預(yù)防組肝組織中的的α-SMA、?型膠原和TIMP-1表達(dá)降低。5.與正常組比較，模型組肝組織中的acH3K9、acH3K14、acH3K18修飾水平均降低，有顯著性差異（P<0.01)；與模型組比較，藍(lán)莓治療組、藍(lán)莓預(yù)防組及自然恢復(fù)組肝組織中的acH3K9、acH3K14、acH3K18修飾水平均升高，有顯著性差異（P<0.01)；與自然恢復(fù)組比較，藍(lán)莓治療組及藍(lán)莓預(yù)防組的acH3K9、acH3K14、acH

14、3K18修飾水平均升高，有顯著性差異（P<0.05)，以藍(lán)莓預(yù)防組升高較為明顯。與藍(lán)莓治療組比較，藍(lán)莓預(yù)防組肝組織中的acH3K9、acH3K14、acH3K18修飾水平升高。
　　結(jié)論：
　　證實(shí)了口服藍(lán)莓可以顯著改善肝纖維化病理改變，降低血清肝功能指標(biāo)ALT、AST及血清肝纖維化相關(guān)指標(biāo)，改善肝臟內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)沉積和代謝，預(yù)防性使用藍(lán)莓對(duì)肝纖維化的改善作用更好。acH3K9、acH3K14、acH3K18組蛋白乙?；揎椄?/p>

15、變可能參與了肝纖維化的發(fā)生及發(fā)展，并與藍(lán)莓改善肝纖維化發(fā)生機(jī)制有關(guān)。
　　第三部分藍(lán)莓提取的花青素在體外對(duì)激活型大鼠肝星狀細(xì)胞株組蛋白乙酰化修飾的影響和增殖凋亡的作用
　　目的：
　　探討藍(lán)莓花青素對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞株（HSCs-T6）增殖與凋亡的影響，并對(duì)藍(lán)莓花青素處理后的HSCs-T6細(xì)胞外基質(zhì)蛋白及組蛋白乙?；揎梐cH3K9、acH3K14、acH3K18位點(diǎn)修飾水平的影響。
　　方法:
　　采用藥理

16、學(xué)的方法提純藍(lán)莓中的花青素。HSCs-T6常規(guī)復(fù)蘇培養(yǎng)后，分別加入藍(lán)莓花青素50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL、200ug/mL。使用實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析儀(RTCA xCELLigence)動(dòng)態(tài)觀察不同濃度藍(lán)莓花青素（50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL、200ug/mL）處理HSCs-T672 h后細(xì)胞增殖的影響，確定合適的花青素濃度及作用時(shí)間；根據(jù)（RTCA）實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇合適的時(shí)間后加入Annexin

17、V-FITC/PI雙染后，熒光顯微鏡下觀察不同濃度藍(lán)莓花青素處理后的HSCs-T6細(xì)胞形態(tài)變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度花青素處理HSCs-T6細(xì)胞凋亡的情況；western blotting檢測(cè)藍(lán)莓花青素最適濃度處理HSCs-T6細(xì)胞36 h，細(xì)胞的α-SMA、Ⅰ型膠原及TIMP-1表達(dá),western blotting檢測(cè)HSCs-T6細(xì)胞acH3K9、acH3K14、acH3K18修飾水平變化。
　　結(jié)果：
　　與對(duì)照組

18、相比，不同濃度藍(lán)莓花青素處理HSCs-T6細(xì)胞36h，均能明顯抑制HSCs-T6細(xì)胞的增殖，呈劑量依賴(lài)性；濃度為50μmol/L時(shí)，HSCs-T6細(xì)胞的存活率低于50%（P<0.05）；免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，隨著藍(lán)莓花青素濃度增加并處理HSCs-T636 h，HSCs-T6凋亡數(shù)量逐漸增加，更多的HSCs-T6細(xì)胞核被PI染成紅色，且呈濃度依賴(lài)性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)的凋亡實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，不同濃度的藍(lán)莓花青素處理HSCs-T6細(xì)胞36 h,

19、隨著藍(lán)莓花青素濃度增加凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與對(duì)照組相比，50 ug/mL濃度的藍(lán)莓花青素處理HSCs-T6細(xì)胞36h,細(xì)胞的α-SMA、Ⅰ型膠原、TIMP-1表達(dá)明顯降低（P<0.05）；與對(duì)照組相比，50 ug/mL濃度的藍(lán)莓花青素處理HSCs-T6細(xì)胞36 h,細(xì)胞的acH3K9、acH3K14、acH3K18修飾水平增加（P<0.01）；
　　結(jié)論：
　　藍(lán)莓花青素可以抑制大鼠激活型HSC細(xì)胞