退變性腰椎間盤髓核內(nèi)MicroRNA-216的表達(dá)對破骨細(xì)胞RANK信號的調(diào)控機制研究.pdf

1、研究背景及意義：
　　退變性腰椎間盤突出癥(Lumber disc herniation，LDH)是經(jīng)常伴有嚴(yán)重的腰腿痛一種綜合征，是脊柱外科常見病、多發(fā)病，常影響患者生活和工作，嚴(yán)重者生活不能自理。目前臨床治療方案包括保守治療和手術(shù)治療，但國內(nèi)外尚未有統(tǒng)一的治療方案。因此有必要對LDH發(fā)生過程中的多種致病因素進行科學(xué)分析，以期對疾病的形成機制有更深入全面的了解，為臨床治療提供更多的有效選擇。研究證實，腰椎間盤的退變過程與多方面有

2、關(guān)，有化學(xué)性機制方面的，也有傳統(tǒng)生物力學(xué)機制方面的，傳統(tǒng)生物力學(xué)的改變可加速化學(xué)性機制方面的改變。退變性LDH所導(dǎo)致的疼痛癥狀與神經(jīng)根受壓無相關(guān)性，而與炎癥性反應(yīng)密切相關(guān)，動物實驗亦證實，髓核具有較強致炎作用。
　　局部炎性環(huán)境下，骨髓腔內(nèi)的血竇發(fā)生血管芽，導(dǎo)致進入軟骨終板的血液減少，切斷了椎間盤獲得營養(yǎng)成分的主要途徑，引起椎間盤退變。炎癥環(huán)境的持續(xù)存在，破骨細(xì)胞數(shù)量的增多和功能的亢進，使骨重塑過程的動態(tài)平衡被打破，骨質(zhì)流失嚴(yán)重，

3、引起一系列的臨床病癥，包括骨質(zhì)疏松、礦物質(zhì)和骨代謝紊亂等等。同時由于破骨細(xì)胞活化，骨量丟失，骨小梁變細(xì)，強度降低;由于單個骨小梁因受力過大而形成微骨折，從而影響椎體松質(zhì)骨、纖維環(huán)和無血管的髓核之間的液體互換狀態(tài)，進一步破壞髓核營養(yǎng)供養(yǎng)的通路，加速了椎間盤的退變。
　　在臨床上，退變性腰椎間盤突出患者影像學(xué)檢查我們常常會發(fā)現(xiàn)有椎體或終板的破壞，這改變了臨近節(jié)段脊柱的生物力學(xué)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致各種各樣的問題，最常見的是反復(fù)下腰痛。但退變性腰椎

4、間盤突出和椎體或終板破壞是否具有相關(guān)性，目前還沒有相關(guān)研究。
　　為了在椎體或終板破壞發(fā)病機制與治療方面尋求突破，本實驗對破骨細(xì)胞進行了重點研究。但是破骨細(xì)胞在退變性LDH中如何被激活，如何發(fā)揮其病理作用的機制目前還不明確。
　　在炎癥性環(huán)境影響下，破骨細(xì)胞的數(shù)量及活性都有不斷增加。破骨細(xì)胞起源于骨髓單核-巨噬細(xì)胞譜系細(xì)胞，在體內(nèi)必須通過基因調(diào)控分化發(fā)育為多核的成熟破骨細(xì)胞?；罨男盘柾分饕擅庖呤荏w酪氨酸活化基序(ITA

5、M)、核因子KB受體活化因子配體(RANKL)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)介導(dǎo)，也包括由一些細(xì)胞因子、生長因子等組成的非經(jīng)典通路。目前認(rèn)為最直接活化破骨細(xì)胞的內(nèi)源性分子是激活RANKL(核因子NF-κ B受體的配體)。RANKL通過和存在于破骨細(xì)胞膜上的膜蛋白受體RANK結(jié)合，募集形成一種復(fù)合體（TRAF6和c.Src復(fù)合體），從而激活下游信號通路，如:NF-κ B、J3、MAPK和Ca2+通路，通過胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑轉(zhuǎn)而激活NF

6、-κB、激活蛋白1等，激活破骨細(xì)胞相關(guān)基因（抗酒石酸堿性磷酸酶，金屬基質(zhì)蛋白酶9，整合素和組織蛋白酶K）的表達(dá)，促進破骨細(xì)胞分化、增強破骨細(xì)胞的骨吸收活性，抑制細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致破骨細(xì)胞數(shù)量增多且功能亢進。
　　細(xì)胞內(nèi)的microRNA(miRNA)是一類自然出現(xiàn)的，包含20-22個氨基酸的非編碼的內(nèi)源性RNA。在真核生物內(nèi)其通過對靶基因mRNA的3'端非翻譯區(qū)(3'untranslated regions，3'UTR)進行識別和

7、結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平影響相關(guān)基因的表達(dá)。隨著越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)，其生物學(xué)效應(yīng)越來越受到重視。miRNA在眾多骨性疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，例如骨腫瘤，骨性關(guān)節(jié)炎，股骨頭壞死等骨代謝相關(guān)疾病等。但microRNA-216(miR-216)的生物學(xué)功能較少得到關(guān)注，它首次發(fā)現(xiàn)于2007年，主要研究集中在胰腺癌中的病理表達(dá)變化。目前雖然一系列研究表明破骨細(xì)胞在退變性腰椎間盤突出癥中扮演重要角色，但是miR-216在破骨細(xì)胞分化過程中的

8、表達(dá)與功能改變情況知之甚少。
　　本實驗通過對臨床手術(shù)后退變性腰椎間盤突出癥患者突出程度進行分類，分析臨床特點，發(fā)現(xiàn)椎間盤突出程度與疼痛癥狀持續(xù)時間及工作性質(zhì)有關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)退變性間盤突出程度越重，出現(xiàn)椎體或終板破壞的幾率越高。通過檢測術(shù)后髓核內(nèi)miR-216表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)有椎體或終板破壞的髓核內(nèi)，miR-216表達(dá)水平降低。通過體外實驗誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在破骨細(xì)胞分化過程中miR-216表達(dá)下降;miR-216通過靶

9、向RANKL-RNAK-NF-κ b信號通路調(diào)控破骨細(xì)胞的分化。本實驗通過miR-216為中心環(huán)節(jié)，發(fā)現(xiàn)在退變性椎間盤在突出過程中，通過miR-216表達(dá)下降，解除了對破骨細(xì)胞的抑制，是造成椎體或終板破壞的原因之一。同時，隨著椎體或終板破壞，椎間盤與椎體之間的物質(zhì)交換通道進一步被破壞，并且隨著損傷時間延長（疼痛持續(xù)時間）以及勞動強度的增加，患者積累性損傷也增加，即在生物力學(xué)及化學(xué)性方面的相互作用下，椎間盤的退變進一步加重，從而形成了惡性

10、循環(huán)。所以研究miR-216的靶基因和它的生物功能方面的機制對于退變性腰椎間盤突出癥的患者來說有著臨床價值，對退變性腰椎間盤突出癥的治療和預(yù)防具有巨大潛力;我們希望，隨著研究的深入，我們能夠有更多的發(fā)現(xiàn)，為臨床治療的新突破提供更有效的靶點。
　　第一部分：
　　研究目的:探討退變性腰椎間盤突出癥患者退變性椎間盤突出程度與臨床特點之間的關(guān)系、退變性椎間盤突出程度與髓核內(nèi)的miR-216表達(dá)水平之間的相互關(guān)系，闡明椎間盤退變程度

11、與臨床特點之間的關(guān)系，同時檢測miR-216在退變性腰椎間盤突出患者髓核內(nèi)的表達(dá)情況。
　　研究方法:本研究入選192例手術(shù)患者，依據(jù)AAOS&ISSLS分類及Pfirmann分級，結(jié)合CT和MRI分組:腰椎間盤膨出組，腰椎間盤突出組，腰椎間盤脫出組，記錄各病例的臨床特點，如性別、年齡、職業(yè)、疼痛程度、病程進展情況、血糖情況等，依據(jù)患者影像學(xué)結(jié)果觀察患者椎體或終板破壞情況，同時觀察不同組間患者臨床特點的改變情況;對照正常組29例，

12、均為年輕，急性暴力外傷，MRI檢查無間盤退變;保留切下有椎體或終板破壞的所有患者的髓核，利用qRT-PCR、Western blot、熒光素酶實驗等技術(shù)，檢測miR-216在正常與退變性LDH患者髓核內(nèi)的表達(dá)改變情況;
　　研究結(jié)果:依據(jù)AAOS&ISSLS分類及Pfirmann分級,結(jié)合CT和MRI等影像特點:椎間盤突出程度，椎間盤壓迫征象如硬膜囊、神經(jīng)根受壓、硬膜外脂肪變形、移位或消失等，還有間盤的信號改變，間盤結(jié)構(gòu)的改變，間

13、盤髓核與纖維環(huán)邊界清晰與否，椎間隙的高度的改變情況，將患者分為腰椎間盤膨出組36例，腰椎突出組117例，腰椎脫出組39例，對照組27例。
　　患者疼痛癥狀出現(xiàn)到手術(shù)的持續(xù)時間，膨出組與突出組和脫出組相比具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05);與椎間盤膨出組相比，從事體力勞動患者的比例在椎間盤突出組與椎間盤脫出組中更高(p＜0.001)。
　　觀察患者CT及MRI影像，發(fā)現(xiàn)患者間盤膨出組椎體或終板破壞占2.8％，突出組占84％，脫

14、出型占95％，各組間P＜0.01，具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　通過qRT-PCR實驗檢測有椎體或終板破壞的退變性腰椎間盤突出癥患者髓核以及其他外傷性患者髓核標(biāo)本中，miR-216表達(dá)量的變化情況。實驗結(jié)果顯示，相較正常對照組，退變性腰椎間盤突出癥患者髓核中，miR-216表達(dá)水平低。
　　研究結(jié)論:
　　1.疼痛癥狀持續(xù)時間與退變性椎間盤突出程度呈正相關(guān);
　　2.勞動強度高者，椎間盤退變程度重;
　　3.退變性

15、椎間盤突出程度重者，椎體或終板的破壞幾率增高;
　　4.有椎體或終板破壞的椎間盤突出患者髓核組織中miR-216表達(dá)下調(diào)。
　　第二部分：
　　研究目的:體外誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的過程中，觀察miR-216與破骨細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵蛋白之間的相關(guān)性，明確miR-216在破骨細(xì)胞生成過程中的調(diào)節(jié)作用及其分子生物學(xué)機制，以期為臨床治療提供新的治療方案。
　　研究方法:測定正常健康供體，采用密度梯度離心法從外周靜脈血分離出

16、單核細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)分化為破骨細(xì)胞并做細(xì)胞鑒定;分別取0，3，6，9，12天培養(yǎng)分化的破骨細(xì)胞，經(jīng)Western-blotting檢測破骨細(xì)胞內(nèi)CALCR、CTSK、TRAP等蛋白的表達(dá);分別取0，3，6，9，12天培養(yǎng)分化的破骨細(xì)胞應(yīng)用Mir VanaTM miRNA Isolation提取試劑盒提取細(xì)胞MiRNA，去掉大分子RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，經(jīng)實時熒光定量PCR擴增目的基因，并做相對量檢測;分別取0，3，6，9，12天培

17、養(yǎng)分化的破骨細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染，經(jīng)Western-blotting檢測破骨細(xì)胞內(nèi)RANK的表達(dá)及熒光素酶報告系統(tǒng)進行驗證;
　　將外周血單核細(xì)胞放入不同的培養(yǎng)基中進行破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化與加入MiR-216的培養(yǎng)基對比，并做破骨細(xì)胞鑒定;各培養(yǎng)組提純小分子MiRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，經(jīng)實時熒光定量PCR擴增目的基因，并做相對量檢測;各培養(yǎng)組培養(yǎng)分化的破骨細(xì)胞，應(yīng)用Western-blotting檢測加入MiR-216與沒有加入

18、MiR216分化后的破骨細(xì)胞內(nèi)CALCR、CTSK、TRAP等蛋白的表達(dá)。
　　研究結(jié)果:
　　1.體外誘導(dǎo)外周血單個核細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞，通過Western blot檢測CALCR、CTSK、TRAP等蛋白表達(dá)增高，TRAP染色亦證實破骨細(xì)胞分化形成;
　　2.qRT-PCR檢測顯示miR-216表達(dá)在破骨細(xì)胞分化過程中表達(dá)下降，提示miR-216可能在破骨細(xì)胞的分化中發(fā)揮作用。
　　3.體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化過

19、程中，轉(zhuǎn)染miR-216，Western blot及qRT-PCR驗證了CALCR、CTSK、TRAP等蛋白及核酸表達(dá)水平降低，TRAP染色亦證實破骨細(xì)胞分化被抑制
　　4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-216，Western blot及熒光素酶報告系統(tǒng)驗證了miR-216可直接靶向RANK。
　　5.Western blot檢測顯示p-NF-kB p65表達(dá)降低，提示miR-216通過調(diào)控RANKL-RNAK-NF-κ b信號通路下調(diào)破