黃精多糖的分離、鑒定及免疫調(diào)節(jié)功效研究.pdf

1、黃精是一種藥食同源的中藥材，其中含有多種對(duì)人體有益的活性成分。黃精多糖作為黃精的主要成分，具有多種生物活性，因此具有很高的應(yīng)用價(jià)值。多糖是一種廣泛存在于動(dòng)物和植物細(xì)胞中天然大分子物質(zhì)，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一。研究表明，多糖具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖和血脂、抑菌和抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用，在功能食品、醫(yī)療保健方面具有良好的發(fā)展應(yīng)用前景。近年來(lái)，中藥多糖的免疫調(diào)節(jié)作用成為研究熱點(diǎn)，取得了很大的進(jìn)展。
　　雖然對(duì)黃精及其多糖的研究有不少文獻(xiàn)

2、報(bào)道，但大多集中在黃精多糖的提取分離純化，粗提物抑制腫瘤生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)血糖、改善記憶等功效的研究，而黃精多糖純提取物的結(jié)構(gòu)鑒定及其免疫調(diào)節(jié)等生物活性的研究相對(duì)較少，并且從體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞分子水平和基因水平闡明黃精多糖對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)及其交互作用，找出其關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)于揭示生物學(xué)功能的發(fā)生機(jī)制具有重大意義。
　　巨噬絀胞作為一種免疫細(xì)胞，具有吞噬和介入炎癥反應(yīng)的作用，它廣泛分布于機(jī)體不同組織中，在天然免疫中發(fā)揮著重要作用。近年

3、來(lái)，大量體內(nèi)外研究證明，許多天然多糖具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能的作用。黃精多糖具有多種重要的生物學(xué)活性，其中最重要的就是免疫調(diào)節(jié)作用，其可以作為免疫調(diào)節(jié)劑，通過(guò)免疫調(diào)節(jié)來(lái)提升機(jī)體的免疫防御能力。
　　本課題有關(guān)黃精多糖的分離、鑒定及免疫調(diào)節(jié)功效的主要研究?jī)?nèi)容分為三部分:(1)黃精多糖的制備、純化、分離以及抗氧化性能評(píng)價(jià)，(2)黃精多糖在巨噬細(xì)胞RAW264.7體外免疫調(diào)節(jié)以及信號(hào)通路研究，(3)環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用

4、及其機(jī)制。
　　黃精多糖的制備和評(píng)價(jià)研究?jī)?nèi)容包括提取、純化、分離以及抗氧化性能的考察。利用水提醇沉法將黃精多糖從黃精中提取出來(lái)，利用Sevage試劑脫蛋白、活性炭吸附法脫色，將所得到的黃精粗多糖進(jìn)行純化。采用DEAE-Sepharose FastFlow離子交換色譜對(duì)黃精多糖進(jìn)一步分離純化，得到四種組分，分別命名為PSP1、PSP2、PSP3、PSP4。采用紅外光譜和核磁共振分析對(duì)分離得到的黃精多糖進(jìn)行初步結(jié)構(gòu)鑒定，通過(guò)Size

5、exclusion chromatography測(cè)定了黃精多糖的分子量，通過(guò)HPLC柱前衍生化法測(cè)定了黃精多糖的單糖組成;體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，黃精多糖具有較好的自由基清除能力和還原能力。
　　黃精多糖體外免疫療效的考察由巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬能力、一氧化氮和細(xì)胞因子調(diào)節(jié)以及信號(hào)通路研究組成。本實(shí)驗(yàn)選用的細(xì)胞模型為小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞系，利用中性紅實(shí)驗(yàn)測(cè)定了巨噬細(xì)胞的吞噬能力，通過(guò)硝酸還原酶法測(cè)定細(xì)胞上清中的一氧化氮(

6、NO)含量，細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的含量以及它們對(duì)應(yīng)的mRNA的表達(dá)分別通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法和RT-PCR來(lái)測(cè)定。利用WesternBlot方法檢測(cè)了RAW264.7細(xì)胞中p38 MAPK、IκB-α、NF-κB p65、iNOS和COX-2的蛋白表達(dá)，并用免疫熒光法檢測(cè)了NF-κB p65的核轉(zhuǎn)移。結(jié)果表明黃精多糖可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬，增加NO、TNF-α和IL-6的分泌。在機(jī)制方面，黃精多糖促進(jìn)了Iκ B-α降解，增強(qiáng)了p38

7、MAPK、NF-κB p65、iNOS和COX-2的表達(dá)，并呈良好的劑量依賴關(guān)系，同時(shí)提升了NF-κB的核轉(zhuǎn)移過(guò)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，黃精多糖具有明顯的免疫增強(qiáng)活性，進(jìn)一步表明其有助于促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)。
　　黃精多糖體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用研究包括:環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力，脾臟T和B淋巴細(xì)胞增殖能力，血清中細(xì)胞因子的免疫應(yīng)答。采用環(huán)磷酰胺建造非特異性免疫功能低下的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，分別從免疫器官指數(shù)、免疫細(xì)胞（T淋巴細(xì)

8、胞、B淋巴細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞）活性以及細(xì)胞因子(TNF-α、IL-2、IL-8、IL-10)的變化等方面考察了黃精多糖免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明:黃精多糖不但能夠提高免疫細(xì)胞的活性，同時(shí)還可以調(diào)節(jié)血清中TNF-α、IL-2、IL-8和IL-10等因子的水平，進(jìn)而平衡Thl和Th2。換句話說(shuō)，黃精多糖能夠提高機(jī)體免疫力。
　　綜上所述，本課題首先提取純化了黃精多糖并對(duì)其結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進(jìn)行了評(píng)價(jià);巨噬細(xì)胞RAW264.7體外免疫活性實(shí)驗(yàn)結(jié)