豬蛔蟲感染期幼蟲差異表達(dá)基因的鑒定和全長(zhǎng)cDNA的克隆與分析.pdf

1、豬蛔蟲(Ascaris sunm,A.suum)是線蟲的一種,在分類上隸屬線蟲綱蛔目蛔科蛔屬,是一種專性寄生蟲,在馬屬動(dòng)物和反芻動(dòng)物體內(nèi)都不寄生。豬蛔蟲病感染普遍,感染率很高,呈世界性流行。成蟲寄生于豬小腸腸腔內(nèi),在豬體內(nèi)寄生的數(shù)量巨大,可達(dá)1000條以上,導(dǎo)致腸腔堵塞,嚴(yán)重?cái)_亂了機(jī)體的消化吸收等功能,幼蟲在豬體內(nèi)移行,導(dǎo)致各器官損害,豬蛔蟲幼蟲還會(huì)在人體寄生,引起一些幼蟲移行癥,如眼幼蟲移行癥。因此,對(duì)豬蛔蟲病的研究具有重要公共衛(wèi)生學(xué)

2、意義。本研究在前期構(gòu)建豬蛔蟲感染期幼蟲消減cDNA文庫并經(jīng)微陣列表達(dá)譜篩選差異表達(dá)基因的基礎(chǔ)上,應(yīng)用半定量RT-PCR對(duì)篩選的基因進(jìn)行驗(yàn)證和鑒定,并采用末端的快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)對(duì)在感染期幼蟲表達(dá)豐度高的基因進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA的克隆和分析。試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1、蟲卵和幼蟲的收集:豬蛔蟲受精卵的收集、感染性蟲卵的成功培養(yǎng)以及其它幼蟲的收集是整個(gè)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)利用低濃度的瓊脂凝膠結(jié)合貝爾曼氏法進(jìn)行分離幼蟲的改良方法,

3、獲得了大量的高純度幼蟲,從而保證了下一步總RNA提取的質(zhì)量。提取良好質(zhì)量的RNA是進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和RACE的關(guān)鍵。
　　 2、感染期幼蟲差異ESTs的鑒定:半定量RT-PCR是將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后擴(kuò)增目標(biāo)cDNA和內(nèi)參cDNA,根據(jù)PCR產(chǎn)物量來計(jì)算樣品中mRNA的相對(duì)數(shù)量。半定量RT-PCR因其高度的靈敏性和特異性仍被廣泛的運(yùn)用。本實(shí)驗(yàn)在已構(gòu)建的豬感染期幼蟲cDNA文庫的基礎(chǔ)上,以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參,利用半定量R

4、T-PCR成功鑒定了8個(gè)豬蛔蟲感染期幼蟲差異ESTs。結(jié)果顯示,鑒定的基因都在感染期幼蟲呈高豐度表達(dá),有些基因只在雌蟲不表達(dá),如15G04;有些基因只在雄蟲不表達(dá),如2G04;大部分基因都能在肺L3表達(dá)。
　　 3、感染期幼蟲差異表達(dá)基因28A02全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增、克隆以及生物信息學(xué)分析:利用Takara公司的5'和3'RACE試劑盒成功獲得了28A02基因的全長(zhǎng)序列,并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析,推測(cè)其可能與線粒體ATP合酶有關(guān)