泥蚶性腺差異轉(zhuǎn)錄組構(gòu)建及Foxl2和PHI-2B基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、泥蚶（Tegillarca granosa）是我國(guó)沿海地區(qū)具有極高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海水灘涂養(yǎng)殖貝類。由于泥蚶工廠化人工育苗技術(shù)的突破、多年累代的大規(guī)模人工養(yǎng)殖以及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，泥蚶種質(zhì)資源衰退日益嚴(yán)重，導(dǎo)致遺傳多樣性降低、生長(zhǎng)緩慢、抗病能力下降等問題的產(chǎn)生，嚴(yán)重阻礙了泥蚶養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。性腺發(fā)育是動(dòng)物繁殖的基礎(chǔ)，研究泥蚶性腺發(fā)育相關(guān)基因和相關(guān)作用機(jī)制，有助于對(duì)其性別決定和生殖過程進(jìn)行調(diào)控，為泥蚶種質(zhì)資源改良提供理論基礎(chǔ)。本研究選取浙江溫

2、嶺養(yǎng)殖的泥蚶，采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)構(gòu)建泥蚶性腺表達(dá)譜，尋找性腺發(fā)育相關(guān)功能基因并進(jìn)行驗(yàn)證，旨在研究雌雄差異基因在性別決定和性別分化過程中的功能。本研究主要結(jié)果如下：
　　1、實(shí)驗(yàn)以性腺發(fā)育成熟期的雌雄個(gè)體各4個(gè)為材料，通過構(gòu)建cDNA文庫(kù)、Illumina測(cè)序、Denovo組裝、unigenes功能注釋和基因表達(dá)定量等構(gòu)建泥蚶性腺表達(dá)譜。通過測(cè)序共獲得63.75 Gb clean data，Q30堿基百分比大于89.46％。De no

3、vo組裝后共獲得214,440個(gè)transcripts和125,673個(gè)unigenes，平均長(zhǎng)度分別為1,122和781 bp。將unigenes與公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，共獲得27,325條unigenes注釋結(jié)果，占基因總數(shù)的21.74%。
　　根據(jù)生物學(xué)重復(fù)性評(píng)估結(jié)果對(duì)雌雄個(gè)體進(jìn)行分組，T05 T08（雄）vs T01 T02 T04（雌）和T06 T07（雄）vs T01 T02 T04（雌）分別有2,140和2,070個(gè)差

4、異表達(dá)基因（Differentiallyexpressedgenes, DEGs）。從中挑選35個(gè)DEGs和5個(gè)在其他相似物種中研究過的unigenes，用qRT-PCR進(jìn)行表達(dá)量驗(yàn)證，結(jié)果表明qRT-PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致。此外，本文在泥蚶性腺轉(zhuǎn)錄組中搜索了其他模式生物中的43個(gè)性別相關(guān)基因，如小鼠（Mus musculus）、斑馬魚（Danio rerio）、果蠅（Drosophila melanogaster）、線蟲（

5、Caenorhabditis elegans）和近江牡蠣（Crassostrea hongkongensis），結(jié)果表明在泥蚶轉(zhuǎn)錄組的功能注釋中共找到23個(gè)基因，有5個(gè)基因在雌雄個(gè)體中的表達(dá)具有顯著性差異，其中CBX8和Foxl2為雌性基因， Sox、β-catenin和Sxl為雄性基因；其余基因（ATRX、DMRT、Dax1、Wnt4、Tra-2和Fem-1等）在雌雄個(gè)體中無(wú)顯著性表達(dá)差異，這些基因可能在性腺發(fā)育早期高表達(dá)，在性腺發(fā)育

6、成熟期降到正常水平。另外，在泥蚶轉(zhuǎn)錄組中還發(fā)現(xiàn)了16,960個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeat, SSRs）和614,710個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（Single nucleotide polymorphism, SNPs）。
　　2、泥蚶Foxl2（ForkheadboxL2）cDNA全長(zhǎng)為2,202bp，包含97bp5’非編碼區(qū)、1,107bp開放閱讀框（Openreadingframe,ORF）和998

7、bp3’非編碼區(qū)。功能結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明 Foxl2開放閱讀框含有 Forkhead家族保守的翼狀螺旋結(jié)構(gòu)域（134-224）、2個(gè)低復(fù)雜性區(qū)域（Lowcomplexityregion,LCR,225-236,262-275）和核定位序列（Nuclearlocalizationsignal,NLS,225-236）。Foxl2基因共編碼368個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)該蛋白的分子量為42.1 kDa，等電點(diǎn)為9.040。氨基酸序列的同源性比對(duì)結(jié)

8、果表明泥蚶Foxl2基因與櫛孔扇貝（Azumapecten farreri）的相似性為45.55%，與太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）的相似性為44.51%，與珠母貝（Pinctada margaritifera）的相似性為43.48%，其中Forkhead保守結(jié)構(gòu)域的相似性高達(dá)93.98%。Foxl2基因的時(shí)空表達(dá)分析結(jié)果顯示該基因在泥蚶成熟期卵巢中的表達(dá)量最高，表明Foxl2基因與卵巢發(fā)育有關(guān)。此外，F(xiàn)oxl2基因在

9、胚胎發(fā)育時(shí)期的配子和 D型幼蟲期表達(dá)量較高，表明該基因可能與配子的發(fā)育和器官的形成有關(guān)。
　　3、泥蚶PHI-2B基因經(jīng)cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（Rapidamplification of cDNA ends, RACE）擴(kuò)增、克隆和全長(zhǎng)驗(yàn)證，共獲得460 bp的基因序列，包括43 bp的5’端非編碼區(qū)、386 bp的核心序列和31個(gè)A組成的polyA尾巴。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得725 bp的基因序列，包括43 bp的5’端非編碼區(qū)和62

10、4 bp的ORF。推測(cè)在泥蚶中存在PHI-2B mRNA前體的可變剪切，預(yù)測(cè)剪切位點(diǎn)在129個(gè)氨基酸之后，導(dǎo)致RACE擴(kuò)增獲得不完整的PHI-2B基因。根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果顯示PHI-2B基因就是精子核堿性蛋白（Sperm nuclear basic proteins,SNBPs），功能結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明PHI-2B基因含有核心H1組蛋白保守結(jié)構(gòu)域和RS保守結(jié)構(gòu)域，該基因共編碼207個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)該蛋白的分子量為21.8 kDa，等電點(diǎn)

11、為12.451。氨基酸序列的同源性比對(duì)結(jié)果表明泥蚶 PHI-2B基因與加州貽貝（ Mytilus californianus）和太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）的相似性均為23.42%，與油黑殼貽貝（Mytilus trossulus）的相似性為22.97%，其中H1組蛋白保守結(jié)構(gòu)域的相似性為56.36%。PHI-2B基因的時(shí)空表達(dá)分析結(jié)果顯示該基因在成熟期精巢中的表達(dá)量最高，在增殖期已經(jīng)出現(xiàn)二態(tài)性表達(dá)，成熟期的二態(tài)性表