固氮施氏假單胞菌環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)代謝相關基因的功能鑒定.pdf

1、分類號：單位代碼：10364密級：學號：13720355安徽農業(yè)大學安徽農業(yè)大學學位論文固氮施氏假單胞菌環(huán)二鳥苷酸（cdiGMP）代謝相關基因的功能鑒定FunctionalacterizationofthecdiGMPMetabolismRelatedGenesftheNitrogenfixingPseudomonasstutzeri研究生：盧佳思指導教師：張云華副教授申請學位門類級別：理學碩士專業(yè)名稱：細胞生物學研究方向：微生物細胞生

2、物學所在學院：生命科學學院答辯委員會主席：2016年6月I摘要環(huán)二鳥苷酸（cdiGMP）是一種廣泛存在于細菌中的第二信使，參與調節(jié)多種生理功能，包括細胞分化、信號傳遞、生物膜形成、致病因子產(chǎn)生以及群體感應系統(tǒng)的調控等。cdiGMP由兩個GTP分子經(jīng)環(huán)化酶（DGCs）合成，而被磷酸二酯酶（PDEs）降解。環(huán)化酶（GTPs）具有保守的GGDEF結構域，磷酸二酯酶（PDEs）具有保守的EAL結構域。在銅綠假單胞菌中sadC為cdiGMP合成的

3、關鍵基因，而bifA基因為cdiGMP的降解基因，這兩個基因分別參與了胞內cdiGMP的濃度調節(jié)，進而影響菌體的運動、生物膜形成等表型。施氏假單胞菌（Pseudomonasstutzei）A1501是一株根際聯(lián)合固氮菌，cdiGMP在該菌中的合成、降解機制還未得到鑒定。為研究A1501菌cdiGMP的合成和降解途徑及其對菌株的影響，本研究將A1501中與銅綠假單胞菌sadC和bifA高度同源的兩個功能基因作為研究對象。通過構建sadC和

4、bifA功能缺失突變株，測定突變株胞內的cdiGMP濃度，進而分析cdiGMP水平的變化對菌體運動、生物膜形成等生理功能的影響。取得的主要研究結果如下：1、基因組分析表明，A1501中含有編碼GGDEF結構域蛋白的基因共有33個，含有編碼EAL結構域蛋白的基因有17個，其中編號為PST_3133的基因編碼氨基酸序列中含有一個GGDEF結構域和一個EAL結構域，與銅綠假單胞菌BifA氨基酸序列同源性高達74%，將其命名為bifA。編號為P

5、ST_1148的基因編碼包含一個GGDEF結構域的蛋白，與銅綠假單胞菌中已報道的cdiGMP環(huán)化酶SadC同源性達到62%，將其命名為sadC基因。采用三親結合的方法分別構建了bifA、sadC功能缺失突變株，以及sadC過表達株和突變株bifA的功能回補株進行后續(xù)研究。2、對sadC突變株的胞內cdiGMP含量及表型進行了測定，結果表明sadC的功能缺失對菌體胞內cdiGMP含量與野生型相比沒有明顯差異，而且對菌株的生物膜形成能力以及

6、固氮能力沒有顯著影響，但是菌體運動能力下降；透射電鏡觀察結果表明，sadC突變株與野生型的鞭毛形態(tài)沒有明顯差異。對sadC過表達菌株的生物膜形成能力進行測定，結果表明sadC過表達菌株的生物膜形成能力比野生型增強約2倍以上。通過測定sadC過表達株胞內cdiGMP含量發(fā)現(xiàn)sadC過表達株胞內cdiGMP含量與野生型相比，提高約140%，說明sadC參與了A1501菌體內的cdiGMP合成途徑。3、測定bifA突變株的胞內cdiGMP含量