Livin通過激活p38-GSK3β通路促進乳腺癌上皮--間質(zhì)轉(zhuǎn)化.pdf

1、據(jù)統(tǒng)計乳腺癌已位居全球女性惡性腫瘤之首，并嚴重影響了女性的健康。其發(fā)病率和致死率仍然高居不下，尤其是發(fā)病率還在不斷增加。而乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的最主要原因。Estrogen receptor(ER)、progesteronereceptor(PR)及human epidermal growth factor receptor-2(HER-2)均呈陰性表達的三陰性乳腺癌，則具有更強侵襲力、較易發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移特點。

2、>　　上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是乳腺癌浸潤和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機制。因此研究乳腺癌EMT發(fā)生的分子機制，對于改善預(yù)后，提高患者的生存率至關(guān)重要。Livin是凋亡抑制蛋白家族之新成員，能夠與凋亡蛋白酶結(jié)合，抑制其所介導(dǎo)的細胞凋亡，促進細胞遷移和侵襲，并與腫瘤的惡性程度增高及不良預(yù)后相關(guān)。最新報道，Livin可促進結(jié)直腸癌EMT發(fā)生。而Livin在乳腺癌EMT和轉(zhuǎn)移中的作用及潛在機

3、制尚不清楚。近些年逐漸有報道，p38和糖原合成激酶3β（glycogen synthesis kinase，GSK3β）與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及EMT發(fā)生有關(guān)。我們前期實驗已證實，抑制p38通路活性可下調(diào)p-GSK3β表達水平，從而增加GSK3β活性，降低乳腺癌細胞的侵襲能力。那么，Livin能否通過激活p38/GSK3β通路調(diào)控EMT過程，從而促進乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移成為我們主要探討的問題。
　　本研究主要探討了p38/GSK3β通路在L

4、ivin調(diào)控乳腺癌EMT發(fā)生中的作用及機制，不僅對Livin在乳腺癌中的生物學(xué)功能的研究加以補充，而且還將為乳腺癌EMT發(fā)生機制的研究提供新思路。
　　目的:
　　1、檢測Livin在乳腺癌組織和細胞系中的表達并分析其與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　2、研究Livin對乳腺癌細胞遷移侵襲能力和EMT的影響。
　　3、探討p38/GSK3β通路在Livin誘導(dǎo)乳腺癌EMT中的作用機制。
　　方法:

5、>　　1、檢測Livin在乳腺癌組織和細胞系中的表達并分析其與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　(1)收集中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院及濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科存檔的150例乳腺癌組織（包括33例三陰性乳腺癌和117例非三陰性乳腺癌）及30例癌旁非腫瘤組織蠟塊標(biāo)本。另收集中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科手術(shù)切除的16對新鮮原發(fā)性乳腺癌和相應(yīng)癌旁非腫瘤組織標(biāo)本。
　　(2)Western blot和Real time RT-PC

6、R檢測乳腺癌組織及乳腺癌細胞系中Livin表達情況。
　　(3)免疫組織化學(xué)檢測Livin在乳腺癌組織中的表達，分析其與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　2、研究Livin對乳腺癌細胞遷移侵襲能力和EMT的影響
　　(1)在Livin相對表達量低的非三陰性乳腺癌細胞系中過表達Livin，在Livin相對表達量高的三陰性乳腺癌細胞系中敲除Livin。
　　(2)通過劃痕實驗、Transwell小室遷移和Matri

7、gel侵襲實驗探討Livin對乳腺癌細胞遷移和侵襲能力的影響。
　　(3)通過Western blot、免疫熒光和免疫組化實驗探討Livin對乳腺癌EMT相關(guān)分子表達的影響。
　　3、探討p38/GSK3β通路在Livin誘導(dǎo)乳腺癌EMT中的作用機制
　　(1)通過Westernb lot檢測乳腺癌細胞敲除或過表達Livin對p38/GSK3β通路相關(guān)分子表達的影響。
　　(2)通過Western blot檢測加

8、入p38和GSK3β通路抑制劑對乳腺癌細胞p38/GSK3β通路相關(guān)分子及EMT相關(guān)分子表達的影響。
　　結(jié)果:
　　1、Livin在乳腺癌組織中高表達
　　(1)乳腺癌組織中Livin的mRNA和蛋白表達水平均高于相應(yīng)癌旁非腫瘤組織。
　　(2)Livin主要于乳腺癌癌細胞胞漿內(nèi)呈陽性表達。Livin在乳腺癌組織中的陽性表達率明顯高于在癌旁非腫瘤組織中的陽性表達率。
　　2、Livin在乳腺癌細胞系中高表

9、達
　　(1)Livin在乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞系中蛋白和mRNA表達水平明顯高于正常乳腺上皮MCF-10A細胞系。
　　(2)Livin在三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞系中表達高于非三陰性乳腺癌MCF-7細胞系。
　　3、Livin表達與乳腺癌臨床病理特征具有相關(guān)性
　　(1)Livin的陽性表達與乳腺癌（特別是三陰性乳腺癌）的高TNM分期和腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)。
　　(2)Li

10、vin在三陰性乳腺癌組織中表達的陽性率略高于在非三陰性乳腺癌組織中表達的陽性率。
　　4、Livin促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲
　　(1)Livin過表達質(zhì)粒明顯增強了Livin的表達水平，Livin-siRNA干擾質(zhì)粒明顯抑制了Livin的表達。
　　(2)Livin過表達組MCF-7細胞的遷移和侵襲能力增強;而Livin干擾組MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲能力減弱。
　　5、Livin調(diào)控乳腺癌細胞EM

11、T過程
　　(1)Livin過表達組的MCF-7細胞E-cadherin表達減少，而N-cadherin和Vimentin表達升高，同時伴隨著Snail、MMP-2、MMP-7表達增加，而Slug表達無明顯變化;而Livin干擾組的MDA-MB-231細胞E-cadherin表達上調(diào)，而N-cadherin和Vimentin表達下調(diào)，同時伴隨著Snail、MMP-2、MMP-7表達降低，Slug表達也無明顯變化。
　　(2)

12、免疫熒光結(jié)果與Western blot結(jié)果一致，Livin過表達使MCF-7細胞的E-cadherin降低，N-cadherin和Vimentin增強;而干擾Livin則引起MDA-MB-231細胞的E-cadherin增高，N-cadherin和Vimentin降低。
　　(3)Livin表達與三陰性乳腺癌N-cadherin和Vimentin表達正相關(guān)，與E-cadherin表達呈負相關(guān);Livin表達與非三陰性乳腺癌Vime

13、ntin表達正相關(guān)，與E-cadherin表達呈負相關(guān)，而與N-cadherin表達無明顯相關(guān)性。
　　6、p38/GSK3β通路參與并影響Livin調(diào)控的乳腺癌細胞EMT過程
　　(1)在乳腺癌MCF-7細胞中過表達Livin后，上調(diào)了p-p38、p-ATF2和p-GSKββ的表達;而在乳腺癌MDA-MB-231細胞中干擾Livin表達后，p-p38、p-ATF2和p-GSKββ的表達降低。
　　(2)在乳腺癌MCF

14、-7細胞中轉(zhuǎn)染Livin后加入p38的特異性抑制劑SB203580，p-ATF2、p-GSK3β以及Vimentin和N-cadherin表達則不再上調(diào)，而E-cadherin表達也不再下調(diào)。轉(zhuǎn)染Livin后加入GSK3β抑制劑SB216763，p-GSK3β、Vimentin和N-cadherin的表達進一步增加，而E-cadherin表達則明顯減少。
　　結(jié)論:
　　1、Livin在乳腺癌組織和細胞系中表達增加，并與乳腺