STING蛋白的初步晶體學(xué)研究.pdf

1、STING蛋白是天然免疫一型干擾素生成通路中的一個(gè)銜接調(diào)控蛋白，在細(xì)菌、病毒和真核病原菌的所引起的天然免疫反應(yīng)中都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[1]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，STING可以作為免疫感受器識(shí)別結(jié)合來(lái)自病原菌中的第二信使分子c-di-GMP而激活下游通路。之前的研究預(yù)測(cè)STING蛋白主要包含一個(gè)預(yù)測(cè)的N端五次跨膜部分(1-173aa)和C端胞內(nèi)可溶性的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(174-379aa)。有關(guān)N端的功能目前仍不清楚，可能與其在細(xì)胞內(nèi)的定位有關(guān)，如

2、之前的研究中發(fā)現(xiàn)其可能定位于線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。C端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain，CTD)可通過(guò)募集相互作用分子而發(fā)揮重要的信號(hào)調(diào)控作用。STING蛋白的氨基酸序列與PDB中任何已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)都沒有同源性，預(yù)示它可能擁有獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)。為闡述STING接受c-di-GMP信號(hào)而發(fā)揮功能的分子機(jī)制，我們利用x-射線晶體學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究。
　　 首先，通過(guò)對(duì)不同STING蛋白的片段在大腸桿菌內(nèi)的表

3、達(dá)分析，我們得到了其可溶性的C端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域片段（149位氨基酸到379位氨基酸），命名為STINGCTD。然后利用座滴法進(jìn)行晶體普篩工作，最后在14.4％PEG3350，0.08M二甲砷酸鈉(PH=6.5)和0.16M氯化鈣和20％(v/v)甘油條件下長(zhǎng)出了晶體。由于坐滴法普篩中得到的晶體難以達(dá)到X-射線衍射及結(jié)構(gòu)解析的要求，因此我們用懸滴法對(duì)STINGCTD蛋白進(jìn)行了晶體的優(yōu)化工作。主要通過(guò)以下幾個(gè)方面:一是將晶體生長(zhǎng)條件中的緩沖液P

4、H和沉淀劑濃度在上述條件附近進(jìn)行拉梯度;二是在晶體生長(zhǎng)緩沖液中加入不同種類的additive和detergent;三是降低晶體生長(zhǎng)的溫度，在4度下進(jìn)行晶體的優(yōu)化培養(yǎng);四是將晶體進(jìn)行乙酸鋰脫水處理。最終我們獲得了適合x-射線晶體衍射并具有較高衍射分辨率的單晶，并在上海同步輻射中心收到了一套2.2(A)的衍射數(shù)據(jù)。初步處理結(jié)果表明STINGCTD的晶體屬C2221空間群，每個(gè)非對(duì)稱單位中含有一個(gè)STINGCTD蛋白分子，該分子與另一對(duì)稱相關(guān)

5、的分子形成一同源二聚體。由于STING蛋白在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有具有較高同源性的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)（大于30％），因此我們考慮用STING蛋白的硒代衍生物來(lái)解決晶體結(jié)構(gòu)解析中的相位求解問題。我們?cè)趎ative蛋白普篩長(zhǎng)出晶體的條件中直接進(jìn)行硒代衍生物晶體的優(yōu)化培養(yǎng)，最終通過(guò)利用native蛋白的晶體進(jìn)行種晶(seeding)的方法獲得STINGCTD硒代衍生物的單晶，并在上海同步輻射中心收到了一套2.70(A)的數(shù)據(jù)。SeMet-STINGCTD

6、的晶體屬P21空間群，每個(gè)非對(duì)稱單位也僅含有一個(gè)SeMet-STINGCTD蛋白分子，該分子與另一對(duì)稱相關(guān)的分子形成同源二聚體。
　　 利用單波長(zhǎng)反常散射發(fā)(SAD)法解析的apo-STINGCTD結(jié)構(gòu)中，STINGCTD以對(duì)稱二體的形式存在，以(Ⅴ)型結(jié)構(gòu)存在，文獻(xiàn)中預(yù)測(cè)的第五段長(zhǎng)α螺旋其實(shí)并不是跨膜序列，而是作為STING胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的組成部分參與二聚體相互作用界面的形成，并在二聚體內(nèi)部參與形成疏水核心，該結(jié)構(gòu)是一種全新的折疊

7、形式。
　　 由于解析的apo-STINGCTD結(jié)構(gòu)中，STINGCTD以同源二聚體(dimer)的形式存在。為了驗(yàn)證STINGCTD二聚體的形成并不是晶體堆積所造成的一種人為結(jié)果，因此我們利用凝膠過(guò)濾層析法對(duì)STINGCTD蛋白在沒有和加入c-di-GMP的情況下的分子大小。結(jié)果表明，STING蛋白在溶液中是以同源二聚體的形式存在，并且不受c-di-GMP的調(diào)控。另外，我們利用等溫滴定量熱法檢測(cè)了STINGCTD與c-di-G

8、MP的親和力，其解離常數(shù)Kd值為3.70uM，復(fù)合物中STINGCTD與c-di-GMP的化學(xué)計(jì)量數(shù)之比為2∶1，即一分子的c-di-GMP結(jié)合兩分子的STINGCTD，這與之前的研究結(jié)果相一致。
　　 為了闡述STINGCTD識(shí)別c-di-GMP的分子機(jī)制，我們對(duì)STINGCTD與c-di-GMP的復(fù)合物進(jìn)行了晶體的優(yōu)化培養(yǎng)，并最終收到了一套2.40(A)的數(shù)據(jù)，通過(guò)對(duì)衍射數(shù)據(jù)的初步分析，我們發(fā)現(xiàn)，c-di-GMP結(jié)合的STI