ERK5信號(hào)通路在雌激素抑制TNF-α誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：雌激素缺乏與骨量丟失密切相關(guān)，且能影響骨組織的力學(xué)響應(yīng)能力。雌激素骨保護(hù)作用的具體機(jī)制尚不十分明確，對(duì)這一機(jī)制的研究有助于揭示絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制，并為其治療提供新思路、新靶點(diǎn)。本課題以ERK5分子為核心，研究雌激素抑制成骨細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制，結(jié)果將為骨量減少性疾病治療藥物的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。
　　方法：⑴體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：隨機(jī)將15只6周齡（性成熟）的雌性昆明小鼠分為5組，每組3只，隨機(jī)選取4組行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)，另外一組行假

2、手術(shù)并作為對(duì)照。術(shù)后3天開(kāi)始給予不同藥物干預(yù)，對(duì)照組平行喂養(yǎng)，切除卵巢的4組中，一組平行喂養(yǎng)，一組每日按50mg/kg體重的劑量腹腔注射ERK5特異性阻斷劑XMD8-92一次，一組每日按5mg/kg體重的劑量皮下注射17β-雌二醇一次，一組每日分別按50mg/kg、5mg/kg體重的劑量腹腔注射 XMD8-92并皮下注射17β-雌二醇各一次，每周行雙能 X線(xiàn)骨密度檢查監(jiān)測(cè)股骨骨密度的變化情況，當(dāng)單純摘除卵巢組骨密度下降至與初始值相比較差

3、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)終止實(shí)驗(yàn)，麻醉下頸椎脫臼法處死小鼠收集股骨標(biāo)本，每組樣本經(jīng)固定后對(duì)股骨遠(yuǎn)端干骺端部位分別行Micro-CT掃描和組織學(xué)檢查。⑵體外實(shí)驗(yàn)：首先對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠源性MC3T3-E1成骨細(xì)胞分別孵育不同時(shí)間和不同濃度的17β-雌二醇，通過(guò)Western-Blot研究雌激素活化ERK5的規(guī)律，明確最佳激活濃度及時(shí)間。再通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、Hoechst33258染色及TUNEL/DAPI復(fù)染研究不同干預(yù)條件下成骨細(xì)胞的凋亡情況，明確

4、 ERK5在成骨細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)中的作用。最后通過(guò)Western-Blot及酶標(biāo)儀檢測(cè)不同干預(yù)條件下成骨細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)量的差異，明確ERK5在成骨細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)中的具體作用機(jī)制。
　　結(jié)果：①體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：骨密度監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，在最初的一段時(shí)間內(nèi)，各組骨密度變化均不明顯，各組間也沒(méi)有明顯差異。隨著時(shí)間的推移和用藥的繼續(xù)，各組小鼠骨密度開(kāi)始出現(xiàn)較明顯的變化趨勢(shì)，組間差異也逐漸變得明確。8周后終止實(shí)驗(yàn)，單純摘除卵巢組小鼠骨密度較初始值及對(duì)照組分

5、別降低38.07％和37.06%；而切除卵巢后腹腔注射ERK5特異性阻斷劑XMD8-92組小鼠骨密度較對(duì)照組降低47.89%，更較單純摘除卵巢組小鼠骨密度低17.21%；切除卵巢后外源性補(bǔ)充雌激素組小鼠骨密度較單純摘除卵巢組小鼠骨密度增高151.78%，甚至比對(duì)照組小鼠骨密度增加55.92%；摘除卵巢后先注射XMD8-92阻斷ERK5活化再外源性補(bǔ)充雌激素組小鼠骨密度較單純外源性補(bǔ)充雌激素組降低32.45%。Micro-CT掃描及三維重

6、建結(jié)果顯示，同對(duì)照組相比，切除卵巢后小鼠骨小梁體積、數(shù)目及厚度分別減少30.45%、42.30%和17.81%，小梁間隙增寬35.89%；卵巢切除后與ERK5特異性阻斷劑XMD8-92聯(lián)合干預(yù)下小鼠骨小梁數(shù)目更少，體積及厚度也更小，小梁間隙更寬；卵巢切除后給予外源性補(bǔ)充17β-雌二醇組骨小梁體積、數(shù)目及厚度分別較單純摘除卵巢組增加310.50%、196.91%和323.39%，小梁間隙減少81.95%；而在卵巢切除同時(shí)給予XMD8-92

7、和雌激素干預(yù)組小鼠骨小梁體積、數(shù)目及厚度較單獨(dú)給予雌激素干預(yù)時(shí)分別減少62.42%、38.71%和65.55%，小梁間隙增加185.20%。HE染色結(jié)果與骨密度監(jiān)測(cè)及Micro-CT掃描結(jié)果一致。②體外實(shí)驗(yàn)：對(duì)小鼠源性 MC3T3-E1成骨細(xì)胞孵育10（-6）mol/L的17β-雌二醇，隨孵育時(shí)間延長(zhǎng)，ERK5活化水平增加，在15min時(shí)達(dá)到高峰（77.80±7.70%），之后迅速降低；用不同濃度的17β-雌二醇（10（-9）-10（-

8、5） mol/L）分別孵育成骨細(xì)胞15min，發(fā)現(xiàn)ERK5活化水平隨17β-雌二醇濃度的增加而增加，在10（-6）mol/L已達(dá)高峰（52.16±8.87%）；5umol/L的XMD8-92孵育1h能有效阻斷ERK5的磷酸化。流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，40ng/ml的TNF-α能有效誘導(dǎo)MC3T3-E1成骨細(xì)胞發(fā)生凋亡(49.10±5.29%)，10（-6）mol/L的17β-雌二醇孵育15min有效刺激 ERK5活化并顯著降低 TNF-

9、α誘導(dǎo)的凋亡率（14.51±3.04%），XMD8-92阻斷雌激素對(duì)ERK5的活化后TNF-α誘導(dǎo)的凋亡率升至48.29±6.33%。Hoechst33258染色及TUNEL/DAPI復(fù)染結(jié)果類(lèi)似。進(jìn)一步的Western-Blot及酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果顯示，TNF-α作用下成骨細(xì)胞Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)減少，Bax/Bcl-2比例增加，Caspase3活性增加；17β-雌二醇預(yù)處理刺激ERK5活化后Bax表達(dá)減少，Bcl-2表達(dá)增加，

10、Bax/Bcl-2比例減小，Caspase3活性降低；XMD8-92阻斷雌激素對(duì)ERK5的活化后Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)減少，Bax/Bcl-2比例增加，Caspase3活性增加。
　　結(jié)論：⑴ERK5信號(hào)通路參與雌激素的骨保護(hù)作用，與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展有關(guān)；⑵雌激素以時(shí)間、濃度依賴(lài)的方式激活成骨細(xì)胞內(nèi)ERK5后，通過(guò)上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bax表達(dá)，增加Bcl-2/Bax比例，進(jìn)而抑制Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制T