家蠶幾種尿苷二磷酸-葡萄糖基轉移酶的基因表達與功能研究.pdf

1、家蠶(Bombyx mori)天然有色蠶繭分為紅黃繭系和黃綠繭系兩大類。決定黃紅繭系繭色的色素主要來自桑葉中的胡蘿卜素(β-胡蘿卜素、新生β-胡蘿卜素等)和葉黃素類色素(葉黃素、蒲公英黃質、紫黃質、次黃嘌呤黃質等),而黃綠繭系的色素主要為黃酮類化合物。家蠶從桑葉中攝入的黃酮類化合物,需要在體內進行化學修飾之后方能顯現出綠繭色,但綠繭色的形成以及黃酮類色素的化學修飾分子機理,特別是基因調控機理目前還不清楚。
　　 尿苷二磷酸.葡萄

2、糖基轉移酶(UGTs)是一群廣泛分布于動物、植物、細菌以及病毒,與糖基化有關的蛋白酶超家族。該類酶催化核苷酸的糖基轉移到受體分子的糖苷配基上,從而使受體分子從疏水性轉變成親水性。昆蟲利用UGT酶的糖基化作用降解食物中的有毒植物化學物質,以抵抗食物有毒成分對機體造成的危害,UGT酶甚至還與殺蟲劑的抗藥性有關。
　　 家蠶等昆蟲從植物攝取的黃酮類化合物在體內需要經過一系列如UGT酶參與的糖基化作用等化學修飾,而家蠶繭層中的黃酮類化合

3、物分子結構也與桑葉中的黃酮類化合物明顯不同,家蠶從桑葉攝取的一類黃酮類化合物槲皮素,先在中腸生成5.氧糖苷槲皮素,后在絲腺生成4’5’-雙氧糖苷槲皮素。已知家蠶綠色繭的繭色形成主要由黃酮化合物的含量所決定,可以推測,UGT酶的基因家族可能與黃酮類色素在家蠶體內的轉移,以及蠶繭的成色有關。
　　 家蠶是鱗翅目模式生物,其天然有色繭是具有重大應用前景的遺傳資源。由于家蠶繭色受多基因調控,遺傳機制了解不詳,挖掘和研究繭色調控基因是被公

4、認的有效突破口之一。本文依靠家蠶基因組數據庫資源,利用分子克隆、RACE、RNAi、bac-to-bac昆蟲細胞表達等技術手段,對鱗翅目模式昆蟲家蠶的葡萄糖基轉移酶基因的表達模式和功能進行了研究,希望進一步揭示UGT基因的功能,以及家蠶繭色的形成機理,為繭色分子標記和分子設計育種提供幫助,主要結果如下:
　　 1.首次在家蠶中克隆出4種尚未克隆的葡萄糖基轉移酶基因,包括UGT013830(UGT30)、UGT013834(UGT

5、34)、UGTO13859(UGT59)、UGT013860(UGT60)基因。利用RACE技術成功的克隆出UGT30基因的全長cDNA,其長度為2136bp(登錄號為:HQ833816)。根據已有報道,選取了7種在中腸和絲腺中表達量較高的UGT基因,包括UGT30、UGT34、UGT59、UGT60、UGT013865(UGT65)、UGT010286(UGT86)和UGT010289(UGT89),對其中一些基因做了時空表達的調查。

6、
　　 2.為了研究UGT酶對家蠶繭色的影響,用RT-PCR方法對以上7種基因在白繭品種C108和皓月、綠繭品種火造和G1、黃繭品種Y12和黃繭限性品種Ys的絲腺、中腸和生殖腺組織中的表達進行了定性與定量分析。結果顯示,UGT30、UGT86和UGT89具有綠繭品種特異性表達,可能與綠繭色形成有關,而UGT30在不同繭色品種還存在mRNA轉錄本的差異。
　　 3.進一步闡明這些UGT基因的作用,我們選取了UG730,具有

7、綠繭品種特異性表達的基因,以體外轉錄合成長鏈dsRNA,并優(yōu)化了注射家蠶體內的濃度。由于dsRNA注射的有效時間是36-72 h,我們采取在大造品種5齡期間共兩次注射5μg／dsRNA。家蠶在注射dsRNA UGT30后,出現死亡率增加、發(fā)育變緩?？赡苁怯捎诩倚Q發(fā)育過程中UGT30蛋白對于物質在體內代謝的起到重要的作用,UG730基因表達量下調將導致家蠶體質變弱,不能正常生長。另外,檢測注射前后絲腺和中腸總黃酮含量,結果顯示總黃酮含量在

8、注射前后幾乎未發(fā)生改變。而后我們又采用Real time PCR方法,選取了UGT30和UGT86基因,對家蠶5齡幼蟲不同組織中的轉錄水平以及蛻皮激素和植物次生代謝物誘導下5齡幼蟲不同組織中的轉錄水平進行了測定。
　　 4.以Bac-to-Bac桿狀病毒感染的Sf9昆蟲表達系統獲得了大量高活性UGT86和UGT30重組蛋白；將重組后的粘粒與陽離子脂質體結合后轉染Sf9細胞,獲得重組桿狀病毒,感染Sf9細胞72h后收集蛋白,采用R