新型合成水蛭肽Hirulog-s的體內(nèi)外溶栓作用研究.pdf

1、血液中凝血和抗凝血、纖溶和抗纖溶系統(tǒng)保持動態(tài)平衡，共同維持血液的流動性，一旦平衡失調(diào)，可導(dǎo)致血管內(nèi)凝血，形成血栓栓塞性疾病，或引起出血性疾病。目前國內(nèi)外臨床使用的治療血栓栓塞性疾病藥物主要包括抗凝血藥物、抗血小板藥和纖維蛋白溶解藥。在這些藥物中肽類（小于100個氨基酸）抗凝血藥物，如水蛭素、比伐盧定以及可口服的小分子類肽藥物（如希美加群）等，具有起效快、副作用較低等突出優(yōu)點(diǎn)，是今后抗凝溶栓藥的重點(diǎn)發(fā)展方向。新型的抗凝溶栓藥物不僅可以從抗

2、凝血酶途徑發(fā)揮溶栓作用，而且對纖溶酶途徑也有促進(jìn)作用。本文研究了新型合成水蛭肽Hirulog-s在體外的纖溶酶促動力學(xué)和體內(nèi)的溶栓效果，以及對纖維蛋白活性的影響，進(jìn)而評價了Hirulog-s對纖溶系統(tǒng)的藥理作用。
　　第一章綜述了凝血酶抑制劑在血栓栓塞性疾病中的作用機(jī)理和臨床用藥特點(diǎn)。凝血酶抑制劑按以凝血酶為靶點(diǎn)，用凝血酶抑制劑來抑制血栓的生成是臨床治療血栓的方法之一。凝血酶抑制劑按作用機(jī)制可分為間接凝血酶抑制劑和直接凝血酶抑制劑

3、。間接凝血酶抑制劑如肝素、華法林等在治療血栓形成過程有其應(yīng)用價值，但存在一定局限性。而臨床直接凝血酶抑制劑有優(yōu)于肝素等抗凝藥物的功效，同時也存在一定缺點(diǎn)，所以人們開始研究新的抗凝溶栓藥物。近年來，運(yùn)用先進(jìn)的生物工程技術(shù)已成功開發(fā)了多種直接凝血酶抑制劑已被用于臨床，治療效果優(yōu)于傳統(tǒng)抗凝藥物。而新型的凝血酶抑制劑還需要更加深度地研究其作用機(jī)理和臨床效果。
　　第二章構(gòu)筑單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑（pro-uPA）和纖溶酶原（plg）相

4、互活化反應(yīng)的體外纖溶體系，添加Hirulog-s成反應(yīng)體系不同濃度，比較pro-uPA和plg相互活化反應(yīng)體系中纖溶酶（plm）作用于pro-uPA反應(yīng)的酶促反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)（Km，kcat），分析Hirulog-s對plm作用于pro-uPA反應(yīng)的催化速率及親和性。纖溶活性作用檢測采用底物酶促反應(yīng)法，酶促反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)的測定基于單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑激活纖溶酶原的反應(yīng)。在plm作用于pro-uPA的反應(yīng)體系中，30μmol·L-1

5、Hirulog-s與對照相比kcat值增大了3.1倍，Km值減小了1.6倍，表明Hirulog-s可以顯著提高plm的最大催化速率同時增強(qiáng)親和性。30μmol·L-1 Hirulog-s與對照相比kcat/Km值增大了4.75倍，表明Hirulog-s明顯提高了plm的催化效率。通過活性對比表明Hirulog-s的纖溶活性強(qiáng)于水蛭肽比伐盧定（Hirulog-1）。
　　第三章研究新型合成水蛭肽Hirulog-s體內(nèi)溶血栓藥效作用。

6、基于體外纖溶實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步評價Hirulog-s的體內(nèi)溶血栓作用。通過建立FITC-肺血栓大鼠模型，以生理鹽水組作為對照組，pro-uPA組作為陽性對照組，Hirulog-s分高、中、低不同劑量組進(jìn)行處理，以及與Hirulog-1高、中、低不同劑量組進(jìn)行對比，給藥12h后檢測血漿熒光值變化情況并進(jìn)行肺切片組織形態(tài)學(xué)觀察，評價Hirulog-s高、中、低不同劑量的溶栓效果。結(jié)果表明在急性大鼠肺血栓栓塞模型中，注射1.6mg/kg·bw的Hi

7、rulog-s后的肺組織切片圖顯示肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁均勻，殘存著肺血栓溶解后的痕跡效果最好，與陽性對照pro-uPA類似。而Hirulog-1的溶栓效果通過肺組織切片觀察不明顯，效果不如Hirulog-s。通過檢測大鼠血漿中熒光強(qiáng)度值發(fā)現(xiàn)1.6 mg/kg·bw的Hirulog-s在肺血栓大鼠血漿中熒光強(qiáng)度值相比對照組表現(xiàn)極顯著差異，其在體內(nèi)的纖維蛋白溶解作用與pro-uPA相當(dāng)。
　　第四章研究新型合成水蛭肽Hirulog-s

8、對大鼠纖維蛋白活性的影響。研究對象Wistar大鼠通過尾靜脈注射高、中、低不同濃度的Hirulog-s，同樣以pro-uPA作為陽性對照，采用加鈣法檢測血液優(yōu)球蛋白溶解時間，ELISA試劑盒檢測血液中纖維蛋白原和纖維蛋白原降解產(chǎn)物的含量。數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)后表明處理120min后優(yōu)球蛋白溶解時間被縮短了32s-40s，Hirulog-s處理組與生理鹽水對照組之間具有顯著差別（P＜0.05），表明Hirulog-s提高了大鼠血漿中的纖溶活性。在