乙?；揎椪{(diào)控代謝網(wǎng)絡(luò)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的機制的研究.pdf

1、蛋白質(zhì)的乙?；鳛橐环N關(guān)鍵的蛋白翻譯后修飾越來越受到人們的廣泛關(guān)注,但是此前的研究大多集中在以組蛋白和核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子為底物的乙?；芯?我們運用質(zhì)譜的方法,以人肝組織的細胞質(zhì)為樣品,對乙酰化底物蛋白進行蛋白組學水平的掃描,發(fā)現(xiàn)了一系列代謝酶被乙?；揎?揭示乙酰化修飾與各種代謝途徑關(guān)系密切。
　　為了進一步確定乙?；揎棇Υx途徑的調(diào)控作用,我們選取了磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK1)為研究對象進行了深入研究。PEPCK1是調(diào)節(jié)

2、糖異生的關(guān)鍵酶,PEPCK1催化的步驟是糖異生途徑的第一步且這個反應不可逆。我們通過實驗發(fā)現(xiàn):
　　一.PEPCK1可以被乙?；揎椙沂艿郊毎麅?nèi)能量的調(diào)控。PEPCK1乙?；竽苓M一步促進其泛素化降解,導致PEPCK1蛋白量的減少。細胞通過調(diào)節(jié)糖異生關(guān)鍵酶PEPCK1的乙?；瘡亩{(diào)控細胞自身對高濃度葡萄糖的響應。相反,當細胞處于低糖濃度時,PEPCK1乙?；档?蛋白穩(wěn)定性增加,PEPCK1執(zhí)行糖異生的功能。
　　二.我們通

3、過串聯(lián)親和純化的方法鑒定了一系列和PEPCK1相互結(jié)合的蛋白,其中UBR5是一個具有HECT(HomologoustotheE6-APCarboxyl_Terminus)結(jié)構(gòu)域的泛素化連接酶(E3ligase),實驗證明,UBR5的缺失可以導致PEPCK1蛋白量的上升,UBR5可以和PEPCK1相互結(jié)合,并且兩者之間的結(jié)合受到細胞內(nèi)糖濃度的調(diào)控。這些結(jié)果都證明了UBR5是導致PEPCK1泛素化降解的E3連接酶。
　　三.我們進一步

4、尋找PEPCK1的乙酰化酶和去乙?；?實驗發(fā)現(xiàn),P300是PEPCK1的乙酰化酶,并能增加PEPCK1和UBR5的結(jié)合,促進其降解;而Sirt2是PEPCK1的去乙?；?并減少PEPCK1和UBR5的結(jié)合,使其穩(wěn)定。
　　四.我們通過測定細胞內(nèi)糖濃度和小鼠血糖的實驗來闡述細胞PEPCK1的乙酰化或者泛素化水平對其糖異生功能的影響。實驗證明,Sirt2的缺失能夠影響細胞內(nèi)葡萄糖的濃度;相應的結(jié)果也能通過敲落UBR5,P300得到

5、;另一方面,從小鼠尾靜脈注射針對Sirt2敲落的寡核苷酸,結(jié)果發(fā)現(xiàn),跟對照組相比,小鼠血糖明顯降低。
　　五.我們試圖探討細胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)是通過何種途徑來影響PEPCK1的乙?；?。實驗發(fā)現(xiàn),在高糖濃度下,P300的mRNA水平上升,PEPCK1和P300的結(jié)合也隨之增加;而在低糖濃度下,Sirt2的mRNA水平上升,PEPCK1被去乙酰化。
　　最后我們總結(jié)得出如下的模型:在高糖濃度下,PEPCK1和P300的結(jié)合增加,PE