小鼠骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞對小鼠ITP模型治療作用及機(jī)制的研究.pdf

1、目的：免疫性血小板減少癥（Immune thrombocytopenia, ITP）是一種常見的自身免疫性出血性疾病，目前尚無有效的治療策略，其中慢性難治性ITP有較高死亡率，因治療疾病本身的影響及治療相關(guān)并發(fā)癥，患者生活質(zhì)量差，盡管國內(nèi)外學(xué)者對ITP治療進(jìn)行了大量基礎(chǔ)與臨床研究，這些問題仍然沒有得到有效解決，因此尋找新的治療策略以克服當(dāng)前治療方法的不足，成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)，其中間充質(zhì)干細(xì)胞有可能成為一個選擇，但是相關(guān)的研究資料很少，尚

2、不能為臨床治療提供充足的理論依據(jù)。本研究旨在建立一種穩(wěn)定、高效的從小鼠骨髓中分離間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs）的方法，并通過對其基本的生物學(xué)特性，免疫表型、多向分化潛能及對ITP小鼠模型的治療作用和其可能的作用機(jī)制的研究，以期進(jìn)一步了解BM-MSCs的生物學(xué)特性和臨床應(yīng)用的實際價值，為ITP的治療提供新的研究方向。
　　方法：本實驗研究分為3部

3、分：1、取健康6周C57/BL6小鼠采用頸脫臼法處死，然后分離四肢骨，用PBS沖洗骨髓腔收集骨髓，離心去上清，將采集的骨髓液全部投入培養(yǎng)基中，利用間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長的特性，采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)，多次換液分離出貼壁細(xì)胞，并通過傳代培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞的純化和擴(kuò)增，在倒置相差顯微鏡下對細(xì)胞生長形態(tài)進(jìn)行觀察拍照；取P3代MSCs，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行MSCs免疫表型分析；取一定數(shù)量P3代細(xì)胞分別在脂肪和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中向成脂、成骨誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)一定時

4、間后采用茜素紅及油紅O染色進(jìn)行染色鑒定，以觀察其多向分化的潛能。2、頸椎脫臼法處死8周齡雄性WTC57BL6小鼠，采用眼球摘除法取血，離心收集富含血漿的血小板，并將1×108的血小板通過尾靜脈注射入CD61KO小鼠體內(nèi)，輸入血小板后通過測CD61KO小鼠血清內(nèi)anti-CD61 IgG含量，了解免疫是否成功，免疫成功后處死小鼠取其脾臟，研碎制成脾細(xì)胞懸液，在6h內(nèi)把5×104個上述收集的脾細(xì)胞腹腔注射經(jīng)過200cGy射線照射全身的重度聯(lián)

5、合免疫缺陷（SCID）小鼠，通過檢測SCID小鼠的血小板變化來判斷血小板減少水平，以建立穩(wěn)定的小鼠ITP模型。3、將雄性SCID小鼠分為3組：SCID小鼠對照1組（未處理組）、對照2組（ITP組）、實驗組（ITP+BM-MSCs組），實驗組給予輸注1×106個MSCs，對照組給予同等體積的生理鹽水輸注，輸注后在4d、8d、12d、16d測不同組小鼠血小板水平、并分別在第7d、14d、21d天每組隨機(jī)處死3只小鼠，檢測不同組小鼠外周血和脾

6、臟Treg水平，同時測7d時三組小鼠血清細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的變化。
　　結(jié)果：1、全骨髓貼壁法分離間充質(zhì)干細(xì)胞成功率100%，倒置顯微鏡下細(xì)胞呈形態(tài)均一的梭形，成平行或旋渦狀生長；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示貼壁細(xì)胞均高表達(dá)CD105、CD90及CD73，不表達(dá)造血細(xì)胞表型CD34、CD45和HLA-DR；成脂、成骨誘導(dǎo)多向分化潛能中，成脂誘導(dǎo)14d，可見大量脂滴形成，油紅O染色呈強(qiáng)陽性，成骨誘導(dǎo)21d，

7、茜素紅染色可見礦化結(jié)節(jié)形成。2、CD61KO小鼠輸入來自WTC57BL6純化的血小板后，anti-CD61 IgG的濃度在第14天上升至最高（39.14%±3.68%），至第28天IgG+濃度均維持在較高水平（IgG+＞30%）（44.45%±3.91%）；經(jīng)射線照射全身后的SCID小鼠在接受CD61KO小鼠重新免疫后的脾細(xì)胞后，血小板呈持續(xù)下降，在第7d、第14d、21d及28d血小板水平分別為（401.25±65.34）×109/L

8、、（336.38±60.19）×109/L、（267.38±59.58）×109/L和（209.63±19.62）×109/L，和對照組2比較血小板水平升高明顯，具有顯著性差異（P＜0.01）。3、實驗組小鼠在輸入1×106個MSCs后，第4d、第8d、12d及16d血小板水平分別為（606.11±76.16）×109/L、（611.11±67.85）×109/L、（608.56±47.59）×109/L和（600.44±64.68）×

9、109/L，和對照組2比較血小板水平升高明顯，具有顯著性差異（P＜0.01）；實驗組小鼠脾臟Treg細(xì)胞水平在第7d、第14d及21d分別為2.49%±0.03%、2.67%±0.04%及3.00%±0.02%，對照2組脾臟Treg細(xì)胞水平在第7d、第14d及21d分別為0.79%±0.03%、0.62%±0.07%及0.40%±0.04%，實驗組小鼠脾臟Treg細(xì)胞水平明顯高于對照2組，兩者具有顯著性差異（P＜0.01）；實驗組小鼠外

10、周血 Treg細(xì)胞水平在第7d、第14d及21d分別為1.84%±0.07%、2.46%±0.31%及3.23%±0.23%，對照2組外周血Treg細(xì)胞水平在第7d、第14d及21d分別為0.68%±0.05%、0.52%±0.04%及0.37%±0.08%，實驗組小鼠外周血Treg細(xì)胞水平明顯高于對照2組，兩者具有顯著性差異（P＜0.01）；輸注后d7天測各組小鼠細(xì)胞因子水平，其中對照1組和對照2組血清IL-2水平分別為（30.44±

11、3.97） pg/ml及（42.33±7.94） pg/mL，對照1組小鼠血清IL-2低于對照2組，兩者具有顯著性差異（P＜0.01）；對照1組和對照2組血清IFN-γ水平分別為（132.44±9.15） pg/ml及（153.22±6.96）pg/mL，對照2組小鼠血清IFN-γ高于對照1組，兩者具有顯著性差異（P＜0.01）；對照1組和對照組2血清IL-4水平分別為（52.76±6.89） pg/ml及（39.33±2.12） pg

12、/mL，對照1組小鼠血清IL-4水平高于對照2，兩者具有顯著性差異（P＜0.01）；對照1組和對照2組血清IL-10水平分別為（68.11±3.48pg）pg/ml及（48.00±4.82） pg/mL，對照1組小鼠血清IL-10水平高于對照2組，兩者具有顯著性差異（P＜0.01）；；實驗組血清 IL-2水平和對照2組相比顯著降低（實驗組：39.78±5.78pg/mL，t=2.50，P＜0.01）；實驗組IFN-γ的水平和對照2組相比

13、顯著降低（實驗組143.67±9.18pg/mL，t=2.49，P＜0.01）；實驗組血清IL-4水平和對照2組相比顯著升高（實驗組42.22±2.91pg/mL，t=-2.83，P＜0.01)；實驗組IL-10水平和對照2組相比顯著升高(實驗組55.11±6.74pg/mL，t=-2.58，P＜0.01）。
　　結(jié)論：1、全骨髓貼壁培養(yǎng)法是一種操作簡單、高效的分離小鼠BM-MSCs方法，使骨髓作為一個細(xì)胞治療可靠的來源，有利于M

14、SCs基礎(chǔ)與臨床臨用，值得進(jìn)一步推廣應(yīng)用。2、成功建立了一種制備血小板自身抗體的一種簡易方法，可用于對血小板發(fā)病機(jī)制及治療的進(jìn)一步研究。成功建立了一種ITP小鼠模型，該模型一定程度上模擬了ITP的發(fā)病機(jī)制，克服了其他方法造模的穩(wěn)定性差及可能同時伴發(fā)其他免疫性疾病等的缺點(diǎn)，為進(jìn)一步探討ITP的治療提供了良好的平臺。3、BM-MSCs治療可以升高ITP小鼠血小板水平，對小鼠ITP治療具有一定的效果。其有效的治療機(jī)制可能是由于BM-MSCs可