鏈霉親和毒的原核表達(dá)及復(fù)性.pdf

1、SA(streptavidin下稱SA)是Streptomyces avidinii菌培養(yǎng)過程中外分泌的一種蛋白產(chǎn)物，可以高度特異性地結(jié)合水溶性的維生素，D-生物素(D-biotin)。SA-biotin系統(tǒng)具有親和力高、特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好、信號(hào)放大等優(yōu)點(diǎn)，SA-biotin系統(tǒng)廣泛地運(yùn)用于醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)及組織化學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域。目前SA主要來源于鏈霉菌屬的傳統(tǒng)發(fā)酵和基因工程菌的外源表達(dá)，后者具有生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高、易于

2、純化等優(yōu)點(diǎn)，成為近年來生產(chǎn)研究的熱點(diǎn)。
　　 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)與枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)是當(dāng)前運(yùn)用最為廣泛的兩種原核表達(dá)系統(tǒng)。前者具有過量表達(dá)外源蛋白、生產(chǎn)運(yùn)用廣泛、遺傳及分子生物學(xué)背景清晰等優(yōu)點(diǎn)，而后者具有可外分泌表達(dá)外源蛋白、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)。
　　 本論文運(yùn)用枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)多種形式SA并對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行復(fù)性，目的在于探索獲得高產(chǎn)SA的表達(dá)菌株以及SA高效復(fù)性方案。
　　 本研究通過PCR擴(kuò)

3、增成功獲得三種SA的編碼基因：stv-13（編碼16-133位氨基酸殘基）、csa（編碼13-139位氨基酸殘基）、cnsa（編碼13-159位氨基酸殘基）。將sty-13克隆到B.subtilis表達(dá)載體pP43和pSacR中，構(gòu)建B.subtilisWB800（pSacR-stv-13）蔗糖誘導(dǎo)型表達(dá)菌、B.subtilis WB800（pP43-stv-13）和B.subtilis168(pP43-stv-13)組成型表達(dá)菌株，但

4、均無(wú)明顯外分泌表達(dá)目的蛋白。將sty-13、csa、cnsa克隆到E.coli表達(dá)載體pET22b、pETlla中，構(gòu)建成表達(dá)菌株BL21(DE3)(pET22b-stv-13)、BL21(DE3)(pET22b-csa)、BL21(DE3)(pET11a-cnsa)、BL21(DE3)pLysS(pET22b-stv-13)、BL21(DE3)pLysS(pET22b-csa)、BL21(DE3)pLysS(pET11a-cnsa)、