中藥艾可清中抑制HDAC作用的活性成分研究.pdf

1、目的:
　　艾滋病自發(fā)現(xiàn)以來(lái)便成為了全球性最為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生難題之一。在過(guò)去的研究中，科學(xué)家們通過(guò)HAART對(duì)艾滋病病毒感染者進(jìn)行治療，短期內(nèi)病毒的RNA水平迅速下降，在血漿中可不被檢測(cè)到，然而HIV-1依然能夠在靜息CD4+T細(xì)胞以及其他長(zhǎng)壽細(xì)胞中存活，這些潛伏的前病毒活期感染的細(xì)胞便稱為潛伏病毒庫(kù)。如果沒(méi)有抗逆轉(zhuǎn)錄藥物的進(jìn)攻和抑制，這種病毒休眠體就會(huì)不斷產(chǎn)生新的HIV-1。因此，發(fā)展活化和清除潛伏病毒庫(kù)的潛伏HIV-1病毒活化

2、劑成為了抗HIV/AIDS的難點(diǎn)和研究重點(diǎn)。而HDAC抑制劑可活化正在接受逆轉(zhuǎn)錄療法的HIV感染者的潛伏病毒，且目前發(fā)現(xiàn)了一些天然的HDAC抑制劑，比如:曲古柳菌素A(TrichostatinA，TSA)、白藜蘆醇(Resveratrol)、槲皮素(Quecetin)等等，化學(xué)結(jié)構(gòu)類型廣泛，因此研究和開(kāi)發(fā)天然的HDAC抑制劑用于激活HIV潛伏病毒庫(kù)具有重要意義。
　　方法:
　　在HDAC（組蛋白抗乙酰化酶）活性抑制篩選結(jié)果

3、指導(dǎo)下，從具有HDAC抑制活性的復(fù)方中藥艾可清2號(hào)中篩選活性中藥材;選擇具有明確HDAC抑制作用的中藥材淫羊藿，進(jìn)行化學(xué)成分的有機(jī)溶劑提取，并通過(guò)利用D101大孔樹脂、反相ODS和正相硅膠、SephadexLH-20凝膠等柱層析分離方法分離單體化合物。采用NMR、MS等波譜學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析，鑒定化合物的結(jié)構(gòu);利用HDAC抑制劑篩選試劑盒分析單體化合物的藥理活性，確定艾可清2號(hào)中來(lái)源于淫羊藿的抑制HDAC活性成分。
　　結(jié)果:

4、　　1.中藥復(fù)方艾可清2號(hào)甲醇提取物在濃度為0.25mg/mL～1mg/mL時(shí)，HDAC活性抑制率為23.39％～48.17％;
　　2.從中藥復(fù)方艾可清2號(hào)中發(fā)現(xiàn)，中藥材淫羊藿的甲醇提取物在濃度為0.25mg/mL～1mg/mL時(shí)，HDAC活性抑制率36.02％～73.88％;
　　3.篩選了15個(gè)不同批次來(lái)源的淫羊藿的甲醇提取物，其中編號(hào)為15號(hào)的淫羊藿在50μg/mL～200μg/mL的濃度范圍內(nèi)，HDAC活性抑制率最

5、高，達(dá)到1.87％～29.91％;
　　4.制備淫羊藿(＃15)提取物的乙酸乙酯部位，測(cè)得在濃度為100μg/mL～400μg/mL時(shí)對(duì)HDAC活性的抑制率為24.3％～58.9％，活性抑制率最高。通過(guò)柱層析方法從該活性部位中，分離得到12個(gè)單體化合物。經(jīng)波譜學(xué)分析等方法，分別鑒定為:五味子苷(Schizandriside)(1)，牡荊苷(Apigenin-8-C-glucoside)(2)，槲皮素(Quercetin)(3)，槲

6、皮素-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷(Quercetin-3-O-β-D-arabinopyranoside)(4)，山奈酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(Kaempferol-3-O-α-L-arabinopyranoside)(5)，山奈酚-3-O-β-D-吡喃木糖苷(Kaempferol-3-O-β-D-xylopyranoside)(6)，山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Kaempferol-3-O-β-D-glucop

7、yranoside)(7)，山奈酚-3-O-β-D-乙?；咸烟擒?Kaempferol-3-O-β-D-acetylglucopyranoside)(8)，山奈酚-3-O-(6"-O-反式-對(duì)香豆酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(Kaempferol-3-O-[6"-O-(E)-p-coumaroyl]-β-D-glucopyranoside)(9)，山奈酚-3-O-(2"，4"-O-雙-反式-對(duì)香豆?；?-β-D-吡喃葡萄糖苷(Kaem

8、pferol-3-O-[2"，4"-di-O-(E)-p-coumaroyl]-β-D-glucopyranoside)(10)，異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖(Isorhamnetin-3-O-β-D-glucopyranoside)(11)，以及異鼠李素-3-O-β-D-吡喃木糖苷(Isorhamnetin-3-O-β-D-xylopyranoside)(12)。
　　5.淫羊藿苷在濃度為200μM時(shí)的HDAC活性抑制率

9、僅為15.40％，與同濃度的其他黃酮類化合物山奈酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(54.46％)，山奈酚-3-O-β-D-吡喃木糖苷(45.86％)，山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(43.01％)，異鼠李素-3-O-β-D-吡喃木糖苷(39.67％)，山奈酚-3-O-β-D-乙?；咸烟擒?39.61％)，異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖(36.04％)，槲皮素(30.61％)，槲皮素-3-O-β-D-吡喃阿拉伯糖苷(25.

10、29％)，牡荊苷(24.15％)，山奈酚-3-O-(6"-O-反式-對(duì)香豆?；?-β-D-吡喃葡萄糖苷(23.18％)，山奈酚-3-O-(2"，4"-O-雙-反式-對(duì)香豆?；?-β-D-吡喃葡萄糖苷(22.54％)相比，對(duì)HDAC活性的抑制作用較弱。這些黃酮化合物中對(duì)HDAC活性抑制率較高的化合物為:山奈酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(54.46％)、山奈酚-3-O-β-D-吡喃木糖苷(45.86％)、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡

11、萄糖苷(43.01％)。五味子苷在濃度為50μM～200μM時(shí)，HDAC活性抑制率為-0.88％～1.12％，可認(rèn)為在該濃度范圍內(nèi)，它對(duì)HDAC的活性基本上沒(méi)有影響。
　　6.濃度為100μM時(shí)，山奈酚HDAC活性抑制率為(21.11％)，山奈酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(38.67％)，山奈酚-3-O-β-D-吡喃木糖苷(31.31％)，山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(26.50％)，山奈酚的HDAC活性抑制率低于這