應(yīng)用16SrRNA基因測序技術(shù)初步分析院內(nèi)獲得性銅綠假單胞菌性肺炎患者肺內(nèi)細(xì)菌群落.pdf

1、目的：運用16S rRNA基因測序技術(shù)分析神經(jīng)外科重癥監(jiān)護室（Neurosurgical Intensive Care Unit, NICU）銅綠假單胞菌性院內(nèi)獲得性肺炎（Hospital Acquired Pneumonia, HAP）患者感染前和感染時肺內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能的變化，為HAP的診斷和治療提供新的理念和思路。
　　方法：對自2013年12月至2015年12月NICU住院患者按如下條件進行篩選：1）入院時不合并肺損傷

2、且無肺炎的中重型腦損傷個體；2）入院48小時內(nèi)行氣管切開；3）入院48小時后無HAP下利用纖維支氣管鏡經(jīng)氣管切口采集標(biāo)本，細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果提示陰性；4）首次出現(xiàn)HAP的標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果僅提示銅綠假單胞菌，連著2次及以上培養(yǎng)結(jié)果均僅提示銅綠假單胞菌。將近期有抗生素使用史，不適合做纖維支氣管鏡的，第二次標(biāo)本未取到或培養(yǎng)結(jié)果非銅綠假單胞菌或合并其他病原菌的個體去除。根據(jù)標(biāo)本采集時是否存在HAP將標(biāo)本分為感染前組和感染組，標(biāo)本采集后分為兩份，一份送

3、檢驗科行細(xì)菌培養(yǎng)，一份直接低溫凍存為高通量測序做準(zhǔn)備。臨床信息收集包括流行病學(xué)資料，臨床癥狀及體征、化驗結(jié)果和影像學(xué)檢查結(jié)果等。從群落結(jié)構(gòu)和功能分析銅綠假單胞菌感染性HAP患者感染前和感染時的菌群結(jié)構(gòu)和功能變化。
　　結(jié)果：本項研究共納入來自10例患者自身對照的20份樣本，每例患者感染前和感染時各1份樣本，感染前組和感染組分別含有10份樣本。我們將從不同分類水平、β多樣性、主成分分析、α多樣性和功能基因5個角度對結(jié)果進行分析統(tǒng)計。

4、1）屬水平共有459種菌群，感染前組的優(yōu)勢菌群為嗜血桿菌屬、普氏菌屬、鏈球菌屬和奈瑟氏菌屬，在感染前組和感染組的含量分別為：25.0％vs0.8%、21.0%vs0.8%、12.7%vs5.1%、9.0%vs12.9%；感染組優(yōu)勢菌為普氏菌屬、假單胞菌屬、奈瑟氏菌屬、單食胞菌屬，在感染組和感染前組的含量分別為24.4%vs21.0%、20.2%vs0.3%、12.9%vs9.0%、6.3%vs0.02%。同一個體感染前和感染時菌群共有率

5、較低，均低于60%。459種菌群中的25種分布存在統(tǒng)計學(xué)差異，包括優(yōu)勢菌群：假單胞菌屬、嗜血桿菌屬；2）科水平共有289種菌群，感染前組優(yōu)勢菌群為巴斯德氏菌科，鏈球菌科，普雷沃氏菌科，在感染前組和感染組的含量分別為27.95%vs1.34%、12.65%vs5.11%、11.39%vs11.82%；感染組優(yōu)勢菌為假單胞菌科，奈瑟氏菌和Paraprevotellaceae，在感染前組和感染組的含量分別為20.24%vs0.31%、13.7

6、8% vs9.28%、12.58%vs9.62%。289種菌群中有15種菌群存在統(tǒng)計學(xué)差異，包括優(yōu)勢菌群：巴斯德氏菌科，假單胞菌科。3）目水平共有172種菌群，感染前組優(yōu)勢菌群為巴斯德氏菌目，擬桿菌目，乳酸桿菌目，在感染前組和感染組的含量分別為27.95%vs1.34%，24.33%vs28.66%，13.87%vs5.38%。感染組優(yōu)勢菌為擬桿菌目，假單胞菌目，奈瑟氏菌目，在感染前組和感染組的含量分別為28.66%vs24.33%，2

7、3.28%vs0.58%，13.78%vs9.28%。172種菌群中8種菌群存在統(tǒng)計學(xué)差異，包括優(yōu)勢菌群：巴斯德氏菌目和假單胞菌目。4）綱水平共有87種菌群，感染前優(yōu)勢菌群為γ變形菌綱，擬桿菌綱，芽孢桿菌綱，在感染前組和感染組的含量分別為33.39%vs31.34%，24.33%vs28.66%，14.87%vs5.67%。感染組優(yōu)勢菌為γ變形菌綱，擬桿菌綱，β變形菌綱，在感染前組和感染組的含量分別為31.34%vs33.39%，28.

8、66%vs24.33%，14.48%vs10.03%。87種菌群中僅有3種菌群存在統(tǒng)計學(xué)差異不包括優(yōu)勢菌群。5）在門水平上兩組共有37種菌群，變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門是兩組共同的優(yōu)勢菌群，在感染前組和感染組的含量分別為44.8%vs46.5%，26.4%vs30.6%，18.7%vs12.1%。37種菌群中只有2種存在統(tǒng)計學(xué)差異不包括優(yōu)勢菌群。同一個體感染前和感染時菌群共有率最低為39.1%，最高為88.9%，10個自身對照匹配組中

9、只有1組共有率為39.1%，其余均在60%以上。6）β多樣性分析和屬水平主成分分析利用樣品之間菌群的進化信息以及菌群的豐度信息，進行Unifrac分析，得到樣品間差異的距離矩陣信息，進行PCoA分析和NMDS分析以及應(yīng)用R軟件對屬水平上的分類及菌群豐度進行主成分分析，均發(fā)現(xiàn)相同個體感染前和感染時、感染前組和感染組組間及組內(nèi)樣本間距離較遠(yuǎn)，說明菌群組成差異性較大。7）α多樣性指標(biāo)Chao指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson

10、指數(shù)反映群落多樣性和豐富度的α多樣性指標(biāo)在兩組間分布無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。8）各樣本中群落功能基因共包括7大類和41小類，其中環(huán)境和信息處理中的膜轉(zhuǎn)運、遺傳信息處理中的復(fù)制和修復(fù)、新陳代謝中的糖代謝和氨基酸代謝為感染前組和感染組的共同優(yōu)勢功能基因，比例分別為11.2%、9.7%、9.4%、9.1%和10.1%、8.5%、8.9%、10.1%。41種功能基因中8種存在統(tǒng)計學(xué)差異，其中包括氨基酸代謝相關(guān)基因。
　　結(jié)論：1、感染前組和感染

11、組分析發(fā)現(xiàn)：1）菌群組成在屬、科、目水平上存在明顯差異，尤其是優(yōu)勢菌分布，在綱和門水平上差異較??；2）兩組間菌群進化信息及豐度信息存在明顯差異；3）功能基因分布差異性較小。
　　2、相同個體感染前和感染時標(biāo)本分析發(fā)現(xiàn)：1）菌群組成在屬、科、目、綱水平上存在明顯差異，尤其是優(yōu)勢菌群種類及含量，在門水平上差異較??；2）兩標(biāo)本間菌群進化信息及豐度信息存在明顯差異；3）功能基因分布差異性較小。
　　3、不同個體標(biāo)本在感染前組和感染組