日本三角渦蟲Djwnt1基因的克隆及再生過程中的表達分析.pdf

1、渦蟲屬于扁形動物門(Platyhelminthes)渦蟲綱(Turbellaria),在動物進化進程中出現(xiàn)了一系列發(fā)育上的關(guān)鍵性變化.渦蟲具有強大的再生能力,對其再生機制等方面的研究一直是發(fā)育生物學(xué)研究的熱點問題.Wnt信號途徑是動物發(fā)育中關(guān)鍵的信號途徑之一,對生物的生長發(fā)育有著至關(guān)重要的作用,Wnt信號途徑調(diào)節(jié)影響著許多生命過程,包括細胞形態(tài)與功能的分化與維持、動物胚胎軸方向的形成、免疫、細胞癌變與細胞凋亡等.wnt基因?qū)ι锏陌l(fā)育有

2、著至關(guān)重要的作用,近年來國內(nèi)外對渦蟲的wnt基因進行了不斷的深入研究,研究技術(shù)越來越成熟.
　　本文根據(jù)日本三角渦蟲Djwnt1基因cDNA部分序列和地中海渦蟲的Smed-wnt1基因的cDNA序列設(shè)計引物,采用RACE技術(shù)克隆得到日本三角渦蟲Djwnt1基因的全長cDNA,并對其編碼蛋白的氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析;采用原位雜交技術(shù)檢測了Djwnt1在日本三角渦蟲中的表達情況.已有報道顯示,Djwnt1與渦蟲尾部的再生有關(guān),本文

3、用庚醇處理渦蟲,破壞細胞間隙連接,觀察渦蟲的再生情況,并通過原位雜交技術(shù),檢測渦蟲體內(nèi)Djwnt1的表達變化.
　　Djwnt1 cDNA全長1632 bp,由72 bp的5'非編碼區(qū)(5'-UTR),1263 bp的開放閱讀框(ORF)和297 bp的3'非編碼區(qū)(3'-UTR)組成,其中ORF區(qū)編碼420個氨基酸的Djwnt1蛋白,在3'-UTR末端含有attaaa的加尾信號和24 bp的poly(A)序列.Djwnt1氨基酸

4、序列是由25個氨基酸殘基的信號肽,64個氨基酸殘基的非功能區(qū)和331個氨基酸殘基的功能肽組成的.Djwnt1含有24個保守的半胱氨酸殘基,結(jié)構(gòu)預(yù)測表明,這些半胱氨酸之間可以形成鏈內(nèi)二硫鍵,從而形成短的發(fā)卡結(jié)構(gòu).
　　序列比對表明日本三角渦蟲Djwnt1與地中海渦蟲Wnt1的氨基酸序列之間的相似性最高,為85.2％,而與哺乳動物、魚類、爪蟾和其他無脊椎動物Wnt1之間的相似性相對較低;在進化樹中,哺乳動物、兩棲類動物和魚類處于同一個

5、分支上,說明哺乳動物、兩棲類動物和魚類的同源關(guān)系較近;渦蟲與?？退Ｌ幵谕粋€分支上,其中,渦蟲與水螅進化關(guān)系最近,wnt1基因相似度為34.1％.
　　原位雜交表明,在完整渦蟲中,Djwnt1表達于中軸線靠后的細胞中.切斷渦蟲后,Djwnt1在損傷早期約12 h表達于損傷部位,在面向前端的損傷處和面向后端的損傷處都有表達.48 h后,面向前端的損傷處和面向后端的損傷處Djwnt1的表達有了變化,面向后端損傷處Djwnt1表達持

6、續(xù)不變,且開始聚集于背中線的后極;而Djwnt1在48 h之后在面向極性前端損傷處的不再明顯表達.用庚醇處理渦蟲后,再生過程比對照組要延長一周左右.原位雜交表明,Djwnt1在損傷處的表達延遲約24 h.在36 h時有Djwnt1表達于損傷部位,72 h時在面向極性后端損傷處 Djwnt1表達持續(xù)不變,且開始聚集于背中線的后極,而Djwnt1在面向極性前端損傷處表達量開始下降.96 h時Djwnt1在面向極性后端的損傷處聚集在背中線的后