神經(jīng)膠質細胞中MANF的差異性表達.pdf

1、中腦星形膠質細胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子( Mesencephalic Astrocyte-derived Neurotrophic Factor, MANF),是一種分泌蛋白,約20KD,最初從體外培養(yǎng)的大鼠中腦Ⅰ型星形膠質細胞株中分離出來。它和保守型多巴胺能神經(jīng)營養(yǎng)因子(Conserved Dopamine Neurotrophic Factor, CDNF)同屬于新生的神經(jīng)營養(yǎng)因子保守家族。最近研究發(fā)現(xiàn),體內(nèi)或體外培養(yǎng)的神經(jīng)元受到損傷刺

2、激時MANF的表達會升高。然而MANF在不同類型膠質細胞,尤其是星形膠質細胞中的表達模式尚未明了。為了深入研究這個問題,檢測了正常大鼠和腦缺血大鼠神經(jīng)元MANF的表達量。令人驚訝的是,發(fā)現(xiàn)正常大鼠的大腦皮層中,MANF主要由神經(jīng)元分泌,星形膠質細胞僅在嚴重缺血時表達MANF,這與它的名稱不符合。然而,在體外培養(yǎng)的原代神經(jīng)膠質細胞,包括星形膠質細胞中可見MANF表達,使用ER應激的刺激或營養(yǎng)被剝奪可使MANF表達上調。另外,最有趣的是小膠

3、質細胞MANF的表達模式,皮層和海馬散在的活化的小膠質細胞可表達MANF,但輕度缺血導致的小膠質細胞聚集時MANF無明顯表達。這些結果表明,MANF的表達是可誘導的,且在不同類型的膠質細胞中的表達具有差異性,腦組織中神經(jīng)元是MANF的主要來源。
　　目的:
　　觀察MANF在中樞神經(jīng)膠質細胞中的表達情況。
　　方法:
　　線栓法制作SD大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型,分別缺血2小時和4小時,再灌注24小時后處死大鼠

4、。原代培養(yǎng)的神經(jīng)細胞取自孕16-18天SD大鼠胚胎,皮層和海馬分開研磨、離心、計數(shù)后重懸培養(yǎng)于含血清的DMEM數(shù)天,之后分別用低血清、MG132和衣霉素處理。RT-PCR方法檢測ER應激相關基因轉錄水平,Western Blotting和免疫熒光檢測相關蛋白的表達水平及細胞內(nèi)分布。用PI染色法鑒別死細胞。
　　結果:
　　1.星形膠質細胞中MANF的表達
　　用熒光雙標法檢測大鼠腦組織星形膠質細胞中MANF的表達, G

5、FAP和NeuN分別是星形膠質細胞和神經(jīng)元的標志蛋白。在正常大鼠大腦皮層,MANF主要在NeuN陽性細胞表達,而星形膠質細胞中不表達。輕度腦缺血時,GFAP陰性細胞中MANF表達上調。然而重度腦缺血可誘導星形膠質細胞表達MANF。5％血清培養(yǎng)的正常星形膠質細胞中MANF幾乎不表達。然而ER應激時,包括衣霉素、MG132和無血清培養(yǎng),MANF可被誘導表達。通過RT-PCR和Western Blotting檢測MANF的蛋白和mRNA水平,

6、結果表明腦組織中神經(jīng)元是MANF的主要來源,星形膠質細胞在ER應激刺激下可表達MANF。
　　2.小膠質細胞中MANF的表達
　　為了觀察小膠質細胞中MANF的表達情況,用小膠質細胞的標志性蛋白CD68的單抗和MANF的單抗進行免疫熒光雙標。結果發(fā)現(xiàn),在正常腦組織中有少量CD68陽性的細胞中有MANF表達,而正常的星形膠質細胞中沒有檢測到MANF的表達。另外MANF的表達與小膠質細胞的形態(tài)有關,例如桿狀或靜止狀態(tài)的網(wǎng)狀小膠質

7、細胞不表達MANF,阿米巴樣或圓形的小膠質細胞表達MANF。在缺血的腦組織中,散在的小膠質細胞中MANF免疫反應陽性;而皮層和海馬中聚集的小膠質細胞中無MANF表達。這些結果表明:MANF在小膠質細胞中的表達不僅依賴于其形態(tài),而且與小膠質細胞的狀態(tài)有關。在體外培養(yǎng)的小膠質細胞中也檢測到MANF的表達。5%血清培養(yǎng)的小膠質細胞呈桿狀或網(wǎng)狀,幾乎不表達MANF。衣霉素處理24小時后,小膠質細胞變成阿米巴樣或圓形,此時小膠質細胞中MANF表達

8、上調。
　　3. MANF在少突膠質細胞中的表達
　　在正常大腦皮層中的少突膠質細胞呈現(xiàn)分枝狀,且胞體很小,CNP分布在放射狀的樹突和軸突。腦缺血時MANF在胞體表達,而樹突和軸突表達減少。DAPI雙標檢測到細胞核中有少量的MANF。與星形膠質細胞和小膠質細胞相同的是衣霉素處理后少突膠質細胞中MANF表達上調。這個結果表明腦缺血和ER應激均可誘導少突膠質細胞中MANF的表達。
　　4.原代培養(yǎng)的膠質細胞中MANF的表達

9、
　　Bip和CHOP是ER應激的標志物。用衣霉素、MG132和營養(yǎng)剝奪均可誘導原代培養(yǎng)的神經(jīng)膠質細胞表達MANF。Bip和CHOP的mRNA和蛋白均被上調,而無血清培養(yǎng)對CHOP蛋白水平作用較小。該結果提示,膠質細胞可被誘導出現(xiàn)ER應激及MANF表達。同時,PI染色和DAPI染色結果顯示,衣霉素、MG132處理和無血清培養(yǎng)可引起PI陽性細胞增加,提示ER應激可誘導細胞死亡。
　　結論:
　　以上研究結果表明,在腦組織