熱休克蛋白27(Hsp27)在舌癌化療耐藥中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：
　　舌癌是最常見的口腔惡性腫瘤，其發(fā)生率和死亡率居高不下，當(dāng)前舌癌的治療手段仍然是手術(shù)輔以放療或化療的綜合治療，平陽霉素（P YM）和/或順鉑（cDDP）為主的化療在舌癌的綜合治療中起重要作用，但化療耐藥一直是舌癌成功治療的瓶頸問題。為了探討舌癌細(xì)胞化療耐藥機(jī)制,本課題組前期通過低濃度遞增結(jié)合大劑量反復(fù)誘導(dǎo)舌癌 Tca8113細(xì)胞建立了舌癌多藥耐藥細(xì)胞系（Tca8113/PYM），本研究擬利用該耐藥模型，在差異蛋白質(zhì)組學(xué)方

2、法建立耐藥差異蛋白質(zhì)譜的基礎(chǔ)上篩選鑒定新的耐藥分子,為闡釋舌癌耐藥機(jī)制提供進(jìn)一步證據(jù)。
　　方法：
　?。?）采用蛋白質(zhì)雙向電泳（2-DE）結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）和 ESI-Q-TOF-MS串聯(lián)質(zhì)譜分析構(gòu)建舌癌化療耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)譜；
　?。?）采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入 Hsp27基因或靶向 Hsp27的 shRNA，采用western blot分別檢測各組細(xì)胞 Hsp27的蛋白

3、表達(dá)水平；ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中 Hsp27蛋白含量；分別用人 Hsp27重組蛋白（rhHsp27）和Hsp27中和抗體處理敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞后；M TS法檢測各組細(xì)胞對PYM和cDDP的化療敏感性；
　　（3）將 Hsp27過表達(dá)細(xì)胞 Tca8113/pLEX-Hsp27和其對照細(xì)胞 Tca8113/p LEX-con細(xì)胞建立裸鼠移植瘤模型，體內(nèi)觀察 Hsp27過表達(dá)對舌癌細(xì)胞化療敏感性的影響；
　　（4）分別用w

4、estern blot和ELISA檢測在化療條件下各舌癌細(xì)胞系中和細(xì)胞培養(yǎng)液中 Hsp27的蛋白水平，ELISA檢測正常健康人和有/無經(jīng)過 P YM和/或cDDP化療舌癌患者血清中Hsp27的蛋白水平；
　　（5）通過NF-κB活性的報告基因?qū)嶒灪蛍estern blot檢測Hsp27表達(dá)干預(yù)、rhHsp27或 Hsp27中和抗體處理細(xì)胞中 NF-κB信號通路活性；通過轉(zhuǎn)染sh-RN A干擾舌癌細(xì)胞 TLR5后，觀察 rhHsp2

5、7對 NF-κB信號通路活性的影響，用免疫共沉淀實驗觀察細(xì)胞外Hsp27與TLR5的結(jié)合情況；
　?。?）用Caspase3活性報告實驗結(jié)合western blot檢測Caspase3剪切情況以觀察Caspase3活化情況，用 western blot檢測線粒體和細(xì)胞質(zhì)中凋亡相關(guān)蛋白水平；用免疫共沉淀實驗觀察Hsp27與BAX、BAD及BIM等促凋亡蛋白的結(jié)合情況。
　?。?）收集具備完整臨床資料的舌癌標(biāo)本，通過免疫組化法檢

6、測舌癌組織中Hsp27及其他相關(guān)基因的蛋白水平，分析 Hsp27蛋白水平與舌癌患者預(yù)后的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　?。?）經(jīng)過進(jìn)一步誘導(dǎo)，目前舌癌耐藥細(xì)胞Tca8113/P YM對P YM的耐藥指數(shù)為15.37，對cDDP的耐藥指數(shù)為6.82，并且呈現(xiàn)出明顯的凋亡抗性；
　　（2）差異蛋白質(zhì)組方法發(fā)現(xiàn)18個舌癌耐藥相關(guān)蛋白，其中表達(dá)上調(diào)蛋白12個，下調(diào)蛋白6個，部分差異蛋白驗證結(jié)果與上述結(jié)果差異趨勢一致；
　?。?

7、）耐藥細(xì)胞 Tca8113/PYM中和其培養(yǎng)上清中 Hsp27蛋白水平明顯高于正?？谇徽衬ぜ?xì)胞 Hacat和 Tca8113、SCC-25、SCC-15、SCC-9及CAL-27等化療相對較敏感的舌癌細(xì)胞，化療藥物能上調(diào)舌癌細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中Hsp27蛋白水平，舌癌患者血清中 Hsp27蛋白水平高于正常健康人血清，化療能上調(diào)舌癌患者血清中Hsp27蛋白水平；
　?。?）過表達(dá) Hsp27或用 rhHsp27處理能增加舌癌細(xì)胞對 P

8、YM和 cDDP的耐受性，干擾沉默 Tca8113/PYM中 Hsp27表達(dá)或用 Hsp27中和抗體處理能逆轉(zhuǎn)舌癌耐藥細(xì)胞的化療耐受性；裸鼠體內(nèi)實驗表明過表達(dá) Hsp27能增加Tca8113細(xì)胞對PYM和cDDP的化療耐受性；
　?。?）Tca8113/PYM細(xì)胞中NF-κB信號活性高于其他舌癌細(xì)胞，而IκBα蛋白水平低于其他細(xì)胞，在 Tca8113/P YM細(xì)胞中，干擾 Hsp27表達(dá)或用 Hsp27中和抗體處理能下調(diào) NF-κ

9、B信號活性、p65核移和 p-IκBα水平，上調(diào)IκBα水平；在 Tca8113和SCC-25細(xì)胞中，過表達(dá)Hsp27或用 rhHsp27處理能上調(diào)NF-κB信號活性、p65核移位和p-IκBα水平，下調(diào)IκBα水平；在舌癌組織中 Hsp27高表達(dá)與 p65核移位呈正相關(guān)、與 IκBα蛋白水平呈負(fù)相關(guān)；通過轉(zhuǎn)染 IκBα顯性負(fù)突變載體 pBabe-IκBα或用 NF-κB抑制劑BAY11-7082抑制劑處理能逆轉(zhuǎn) rhHsp27處理誘導(dǎo)

10、的 NF-κB信號活性升高；
　　（6）舌癌細(xì)胞和組織中呈現(xiàn)較高的 TLR5表達(dá)豐度，在 Tca8113/PYM細(xì)胞中，干擾TLR5表達(dá)能下調(diào)NF-κB信號活性、p65核移和p-IκBα水平，上調(diào) IκBα水平；在 Tca8113和 SCC-25細(xì)胞中，干擾下調(diào) TLR5表達(dá)能逆轉(zhuǎn) rhHsp27誘導(dǎo)的 NF-κB信號活性、p65核移和 p-IκBα水平升高， IκBα水平下調(diào)；免疫共沉淀結(jié)果顯示細(xì)胞外rhHsp27能與TLR5相

11、互作用。
　?。?）干擾下調(diào) Hsp27表達(dá)和過表達(dá) Hsp27對舌癌細(xì)胞化療敏感性和 Caspase3活化的影響強(qiáng)于 Hsp27中和抗體和 rhHsp27處理；Hsp27表達(dá)干預(yù)并不能明顯影響化療誘導(dǎo)BAX、BAD和 BIM表達(dá)；但在Tca8113和SCC-25細(xì)胞中，過表達(dá)Hsp27能抑制化療誘導(dǎo)的BAX和BIM向線粒體移位、以及線粒體 Cytochrome C向細(xì)胞質(zhì)的釋放；在 Tca8113/P YM細(xì)胞中，干擾Hsp27

12、表達(dá)則能促進(jìn)化療誘導(dǎo)的 BAX和 BIM向線粒體移位、以及線粒體Cytochrome C向細(xì)胞質(zhì)的釋放；免疫共沉淀結(jié)果顯示 Hsp27能與 BAX和BIM結(jié)合。
　?。?）化療能誘導(dǎo)舌癌組織促凋亡分子 BAX、BAD和 BIM表達(dá)，舌癌組織中Hsp27高表達(dá)與 p65核移位呈正相關(guān)，而與 IκBα蛋白水平和 Caspase3活化呈負(fù)相關(guān)；Hsp27高表達(dá)與舌癌患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　（1）構(gòu)建了舌癌耐藥相關(guān)

13、蛋白表達(dá)譜；
　?。?） PYM/CDDP化療能誘導(dǎo)舌癌細(xì)胞和舌癌患者血清中 Hsp27表達(dá)上調(diào)， Hsp27作為舌癌耐藥的相關(guān)因子，能介導(dǎo)舌癌PYM/CDDP化療耐藥；
　　（3）Hsp27在細(xì)胞外通過與 TLR5相互作用而下調(diào) IκBα功能，從而活化舌癌細(xì)胞中NF-κB信號以介導(dǎo)化療耐藥；
　　（4）Hsp27在細(xì)胞內(nèi)通過與促凋亡分子 BAX和 BIM結(jié)合抑制其向線粒體移位，從而抑制化療誘導(dǎo)的線粒體凋亡信號通路；<