HCV相關(guān)靶標(biāo)與抑制劑相互作用的分子模擬研究.pdf

1、發(fā)現(xiàn)高效專一地抑制在丙型肝炎病毒（hepatitis C virus。HCV）生命周期中起關(guān)鍵作用的蛋白的抑制劑是抗 HCV藥物研發(fā)的重要環(huán)節(jié)。非結(jié)構(gòu)蛋白3/4A（nonsturcture protein3/4A。NS3/4A）、非結(jié)構(gòu)蛋白3解旋酶（nonsturcture protein3 helicase。NS3解旋酶）和非結(jié)構(gòu)蛋白5B（nonsturcture protein5B。NS5B）是抗HCV藥物的重要靶標(biāo)，它們在 HCV

2、復(fù)制和翻譯過程中擔(dān)負(fù)著重要的角色，如對核酸的解旋和易位等。目前，一系列能夠有效地抑制這些蛋白的藥物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，如已批準(zhǔn)上市的針對NS3/4A的藥物波普瑞韋、特拉瑞韋和司美匹韋等。但是HCV耐藥病毒株的出現(xiàn)使得對現(xiàn)有藥物的耐藥越來越嚴(yán)重，耐藥性的產(chǎn)生嚴(yán)重影響了藥物的療效。因此尋找新穎的能夠有效地抗HCV耐藥病毒株的抑制劑迫在眉睫。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷進(jìn)步，分子模擬方法作為尋找新型抑制劑的重要工具已被廣泛應(yīng)用于靶標(biāo)與藥物的作用機(jī)制、耐藥機(jī)制

3、等研究中。如分子動(dòng)力學(xué)模擬、拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬、自適應(yīng)偏置力模擬和 Metadynamics模擬等分子模擬方法都已經(jīng)廣泛應(yīng)用于HCV相關(guān)靶標(biāo)結(jié)構(gòu)和功能的研究當(dāng)中。本論文將從結(jié)構(gòu)和能量的角度詳細(xì)地闡釋相關(guān)抑制劑與 HCV靶標(biāo) NS5B、NS3解旋酶和NS3/4A的相互作用機(jī)制和抑制劑的解離機(jī)制。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為設(shè)計(jì)全新的抗HCV藥物提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　本論文首先簡述了 HCV生命周期的各個(gè)階段、主要的HCV藥物作用靶標(biāo)的結(jié)構(gòu)和

4、功能以及目前針對這些靶標(biāo)上市或在研的藥物。并總結(jié)了分子模擬方法在HCV相關(guān)靶標(biāo)與抑制劑之間的相互作用，靶標(biāo)對抑制劑的耐藥機(jī)制等方面的運(yùn)用情況。然后簡單介紹了本論文用到的幾種分子模擬方法：自適應(yīng)偏置力模擬、拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬和 Metadynamics模擬等?；谶@些模擬方法，本論文的研究內(nèi)容包括4個(gè)部分。
　　論文第一部分闡釋了NS5B突變對抑制劑BMS-791325的耐藥機(jī)制。我們運(yùn)用分子動(dòng)力學(xué)模擬、結(jié)合自由能計(jì)算、氨基酸殘基能

5、量分解和自適應(yīng)偏置力模擬等方法探討了BMS-791325與NS5B蛋白的野生型（WT）、突變型A421V、L392I和P495L的作用機(jī)制。模擬結(jié)果表明NS5B與BMS-791325結(jié)合的關(guān)鍵作用能為疏水相互作用能，NS5B中氨基酸殘基L392、A393、A396、T399、H428、V494、P495和W500的能量貢獻(xiàn)值超過1 kcal/mol。BMS-791325從NS5B解離的第一步為氨基酸殘基R503與BMS-791325之間

6、的親水作用能降低，第二步為拇指區(qū)Ⅰ變構(gòu)位點(diǎn)與 BMS-791325之間疏水作用的消失促使 BMS-791325最終逃離NS5B。氨基酸殘基突變（A421V、L392I和P495L）導(dǎo)致BMS-791325與NS5B結(jié)合親和力和BMS-791325從NS5B解離的平均力勢降低。發(fā)生P495L之后，495位氨基酸殘基骨架環(huán)結(jié)構(gòu)消失，使其周圍的蛋白柔性增大，蛋白不能很好地錨定抑制劑。在A421V和L392I突變型NS5B體系中，突變后氨基酸殘

7、基與抑制劑之間疏水相互作用能的降低是其產(chǎn)生耐藥的主要原因。
　　論文第二部分研究了藥物索菲布韋的三磷酸活性代謝產(chǎn)物 GS-461203及底物UTP與NS5B靶標(biāo)的結(jié)合與解離機(jī)制。我們從晶體結(jié)構(gòu)出發(fā)分別構(gòu)建了三元復(fù)合物 NS5B-RNA-GS-461203和 NS5B-RNA-UTP。GS-461203和 UTP分別與NS5B-RNA的分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果表明：極性和非極性相互作用能對GS-461203與NS5B和UTP與NS5B的結(jié)

8、合是有利的；與UTP相比，GS-461203的2’-氟-2’-碳甲基核糖能夠與氨基酸殘基S282和I160形成很強(qiáng)的作用，使GS-461203能夠競爭性地結(jié)合到 NS5B-RNA結(jié)合位點(diǎn)中。運(yùn)用隨機(jī)加速分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法預(yù)測得到UTP和GS-461203從NS5B-RNA結(jié)合位點(diǎn)的解離路徑是從NS5B手掌區(qū)的背面解離。通過拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬GS-461203和UTP的解離過程發(fā)現(xiàn)，它們的解離過程大致分為3步：小分子的平移，小分子堿基和

9、核糖的翻轉(zhuǎn)和小分子與靶標(biāo)完全分開。S282T對 UTP與 NS5B-RNA的結(jié)合影響較小，但是對GS-461203與NS5B-RNA結(jié)合影響較大。
　　論文第三部分研究了NS3解旋酶與其3個(gè)吲哚環(huán)類抑制劑之間的相互作用。我們運(yùn)用Metadynamics模擬方法研究了抑制劑在NS3解旋酶活性口袋中的作用機(jī)制及解離過程，并構(gòu)建了抑制劑解離過程的自由能表面變化圖。抑制劑的解離過程大致分為吲哚環(huán)1位連接的疏水基團(tuán)構(gòu)象發(fā)生變化之后離開疏水空

10、腔、吲哚環(huán)3位的乙羧基與NS3解旋酶之間的氫鍵斷裂和抑制劑調(diào)節(jié)到利于從NS3解旋酶結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅲ之間的裂縫往外逃離的構(gòu)象而完全解離3步。該類抑制劑的吲哚環(huán)與活性口袋之間有很好的幾何匹配，3位的乙羧基能夠與氨基酸殘基G255和T269形成很強(qiáng)的氫鍵作用，使其構(gòu)成了吲哚環(huán)類抑制劑的基本骨架。吲哚環(huán)1位引入疏水基團(tuán)能夠插入到活性口袋的疏水空腔而阻礙抑制劑的解離；吲哚環(huán)6位引入體積龐大的基團(tuán)能夠增加抑制劑逃離所要克服的空間位阻。
　　論文第

11、四部分研究了NS3/4A突變對BMS-650032的耐藥機(jī)制。分子動(dòng)力學(xué)模擬和結(jié)合自由能計(jì)算的結(jié)果顯示非極性相互作用能在BMS-650032與NS3/4A結(jié)合過程中起到關(guān)鍵作用。根據(jù)殘基能量分解結(jié)果定義了BMS-650032與NS3/4A相互作用的11個(gè)關(guān)鍵的氨基酸殘基。Metadynamics模擬 BMS-650032逃離NS3/4A的活性口袋表明BMS-650032的P2’和P4部分先離開疏水平面，接著P1和P1’部分逃離活性口袋，